CD44干擾對人宮頸癌HeLa細胞體外轉移的影響及其作用機制

莊俊雪，孫景生

(天津市寶坻區人民醫院，天津301800)

CD44是一種廣泛表達于多種細胞和組織的跨膜糖蛋白，可在多種腫瘤組織中表達［1，2］。CD44 有20個外顯子，可以通過選擇性剪切形成多種異構體，在多種組織和細胞中發揮不同的作用［3］。CD44包括胞外部分、跨膜部分和胞內部分，其中胞內部分既可以與細胞內其他信號分子結合參與細胞內的信號傳導，也可以直接與細胞骨架蛋白相結合［4］。研究表明，CD44的胞內部分和細胞骨架蛋白的直接結合在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中發揮重要作用，這可能與膜型基質金屬蛋白酶1(MT1-MMP)的降解以及其他相關分子有關［5］。2011年7月～2012年7月，我們采用特異性shRNA對人宮頸癌HeLa細胞內CD44表達進行干擾，觀察CD44表達降低對HeLa細胞體外轉移能力的影響，并探討其作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 人宮頸癌細胞株HeLa由本院實驗室保存。RPMI 1640培養基及胎牛血清為Gibco公司產品;LipofectamineTM2000和Opti-MEM?I Medium購于Invitrogen公司;Transwell小室購于Millipore公司;Matrigel和 G418購于 BD公司;Real-time RTPCR試劑盒購自Transgen公司;MT1-MMP抗體及ECL顯色液購自R＆D公司。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養 HeLa細胞復蘇后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，置37℃、5%CO2培養箱內。

1．2．2 細胞干擾試驗 取HeLa細胞(1×105/孔)接種在24孔板中，待細胞生長至對數生長期，用無血清培養基清洗3遍，加入500μL無血清培養基。將0．8μg CD44 shRNA 和2μL的 LipofectamineTM2000分別與250μL的Opti-MEMk? I Medium混懸，輕輕混勻后靜置5 min。將含有質粒DNA和LipofectamineTM2000的Opti-MEM?I Medium輕輕混勻后靜置20 min。將混勻的Opti-MEM?I Medium均勻滴入含有無血清培養基的細胞中。5 h后用含有正常血清的培養基終止轉染，24 h后加入終濃度為400μg/mL的G418篩選，2周后篩選結束進行試驗。

1．2．3 細胞劃痕試驗 取一組轉染空載體的HeLa細胞(對照組)和一組經過CD44 shRNA干擾后篩選出的HeLa細胞(觀察組)(2×105/孔)接種在24孔板中，待細胞生長至融合后，用20μL槍尖垂直劃痕，PBS洗去劃掉的細胞，加入無血清培養基，培養箱內常規培養24 h，顯微鏡下拍照。以劃痕損傷愈合的速度判斷細胞遷移能力。

1．2．4 Transwell侵襲試驗 用60μL Matrigel稀釋液(1∶3)包被Transwell小室。取一組轉染空載體的HeLa細胞和一組經過CD44 shRNA干擾后篩選出的HeLa細胞，用含0．1%BSA的 RPMI 1640培養基重懸細胞，上室加入200μL(5×104)細胞懸液，下室加入含20%FBS的RPMI 1640培養液500μL，每組重復3孔，培養箱內常規培養24 h。取出小室，用棉簽擦去上室內的非侵襲細胞，倒置，風干，用0．1%結晶紫對小室背面侵襲的細胞進行染色，顯微鏡下拍照。

1．2．5 Real-time RT-PCR方法 Trizol法提取細胞總RNA，分光光度計測定總RNA濃度，取2μg RNA逆轉錄合成cDNA，按SYBR Green PCR試劑盒說明書加入各反應物，用ABI 7500系統進行擴增反應。反應條件為:95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40個循環。以β-actin為內參照物，β-actin及MT1-MMP引物根據GenBank資料，利用Primer Premier 5．0軟件設計，由上海生工生物公司合成。β-actin上游引物:5'-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3'，下 游 引物:5'-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCT-3';MT1-MMP上游引物:5'-TGCCTGCGTCCATCAACA-3'，下游引物:5'-ATCTTGTCGGTAGGCAGC-3';CD44上游引物:5'-ACCCCAACTCCATCTGTGC-3'，下游引物:5'-TTCTGGACATAGCGGGTG-3'。

1．2．6 Western blot試驗 收集觀察組和對照組的HeLa細胞，裂解緩沖液提取細胞總蛋白，BCA定量試劑盒測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳，蛋白從凝膠電轉至醋酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗(MT1-MMP 1∶200，β-actin 1∶500)4 ℃過夜。次日加二抗(MT1-MMP 1∶5 000，β-actin 1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯影。以β-actin編碼蛋白水平為內參。

1．2．7 統計學方法 采用GraphPad Prism軟件進行統計分析，結果以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 shRNA干擾對HeLa細胞內CD44表達的影響

Real-time RT-PCR結果顯示，CD44 shRNA干擾后，HeLa細胞內CD44的表達水平明顯降低，CD44 mRNA和蛋白的表達水平分別下降40%和50%。見圖1。

圖1 shRNA干擾對HeLa細胞內CD44表達的影響

2．2 shRNA干擾對HeLa細胞遷移能力的影響細胞劃痕試驗顯示，CD44 shRNA干擾后，HeLa細胞的遷移能力明顯低于對照組。見圖2。

圖2 shRNA干擾對HeLa細胞遷移能力的影響(×100)

2．3 shRNA干擾對HeLa細胞侵襲能力的影響Transwell侵襲試驗顯示，觀察組穿過小室濾膜的HeLa細胞數明顯少于對照組，即觀察組HeLa細胞的侵襲能力低于對照組。見圖3。

圖3 shRNA干擾對HeLa細胞侵襲能力的影響(×100)

2．4 shRNA干擾對HeLa細胞MT1-MMP mRNA和蛋白表達的影響 Real-time RT-PCR結果顯示，與對照組相比，觀察組HeLa細胞內MT1-MMP mRNA表達水平明顯降低(P＜0．05)。Western blot結果顯示，與對照組相比，經過CD44 shRNA干擾后，He-La細胞內MT1-MMP蛋白表達水平明顯降低(P＜0．05)。見圖4。

圖4 shRNA干擾對HeLa細胞MT1-MMP mRNA和蛋白的影響

3 討論

腫瘤轉移是惡性腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤的遷移過程分為以下階段:腫瘤細胞與腫瘤附近組織基底膜或細胞外基質的黏附，腫瘤細胞對基底膜和細胞外基質的局部降解，腫瘤細胞加強運動活力并通過血管向遠處轉移。因此，凡是影響腫瘤細胞與癌旁組織細胞的黏附、腫瘤細胞的運動活力以及調節細胞外基質降解的因素都可能參與腫瘤細胞的侵襲與轉移［6］。

CD44是一種跨膜糖蛋白，在多種腫瘤細胞中呈高表達。CD44還是某些腫瘤干細胞的表面標志物。CD44最初作為黏附分子調節細胞與細胞或細胞與組織間的相互接觸，但越來越多的研究表明，CD44的胞內部分可以與細胞內的其他信號分子相結合，調節腫瘤細胞的生長、凋亡、侵襲和轉移。本實驗結果表明，通過特異的shRNA干擾HeLa細胞內CD44的表達水平，可顯著降低HeLa細胞的遷移和侵襲能力，從而抑制HeLa細胞轉移。

基質金屬蛋白酶(MMP)是依賴于鋅離子的蛋白酶，其對細胞外基質和基底膜組分的降解以及一些非基質成分的作用改變了腫瘤細胞的微環境，促進了腫瘤的侵襲和轉移［7］。MMP14/MT1-MMP是MT-MMP家族中首位被發現的成員，其可啟動細胞表面多個蛋白級聯反應。研究發現，MMP14與MMP2相互作用可通過多種機理改變腫瘤細胞生長的微環境，進而促進腫瘤的侵襲和轉移［8］。本實驗結果表明，抑制HeLa細胞內CD44表達，可顯著降低MT1-MMP mRNA和蛋白的表達水平，這可能是導致HeLa細胞侵襲遷移能力降低的主要原因。

綜上所述，HeLa細胞內CD44表達水平降低可顯著抑制HeLa細胞的體外遷移和侵襲，從而抑制其轉移能力，這種抑制效應可能與MT1-MMP表達降低相關。本研究為進一步了解宮頸癌轉移的機制、提供臨床治療藥物的作用靶點提供了理論依據。

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［5］Bourguignon LY，Gunja-Smith Z，Iida N，et al．CD44v(3，8-10)is involved in cytoskeleton-mediated tumor cell migration and matrix metalloproteinase(MMP-9)association in metastatic breast cancer cells［J］．JCell Physiol，1998，176(1):206-215．

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