青藤堿對佐劑性關節炎大鼠行為學特征和滑膜中TNF-α的影響

牟 慧，蔡 輝，姚茹冰，趙智明

(第二軍醫大學臨床學院、南京軍區南京總醫院，南京210002)

中藥青風藤具有祛風濕、通經絡、鎮痛的功效，用于治療風濕痹痛、關節腫痛等已有兩千多年的歷史，目前廣泛用于治療類風濕關節炎(RA)和神經痛等疾病［1］。2012年4～7月，我們觀察了青藤堿對佐劑性關節炎大鼠行為學特征及滑膜中炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達的影響，以探討其改善RA癥狀的機制。

1 材料與方法

1．1 材料 清潔級健康雄性SD大鼠40只，體質量(90±20)g，由南京軍區南京總醫院實驗動物中心提供。甲氨蝶呤(江蘇恒瑞醫藥有限公司)，青藤堿(湖南正清制藥集團股份有限公司)，弗氏完全佐劑(CFA，Sigma公司)，TNF-α 檢測試劑盒(ELISA，Keygen公司);光學顯微鏡(OLUMPUS)，390型足底輻射熱痛覺測試儀和2390-5型觸痛覺測試儀(IITC Life Science，Inc)。

1．2 方法

1．2．1 佐劑性關節炎模型的復制及分組干預 選用40只SD大鼠，適應性喂養1周，隨機分為正常組10只和CFA造模組30只。造模組向大鼠右側后肢足墊皮下注射0．1 mL CFA［2］，以注射后 3 ～4 h 大鼠右側后足出現紅、腫、熱等急性炎癥表現，2～3 d其他肢體亦漸出現繼發性關節腫脹為造模成功。將造模成功大鼠隨機分為模型組、青藤堿組和甲氨蝶呤組各10只，分別給予生理鹽水0．5 mg/(kg·d)、青藤堿 100 mg(kg·d)、甲氨蝶呤 0．5 mg(kg·周)，共4周，于實驗第30天處死全部大鼠。

1．2．2 行為學檢測 ①熱痛閾值(PWL):大鼠造模后第8、16、24、30天用足底輻射熱痛覺測試儀測定PWL。將大鼠放在玻璃板上，用有機玻璃觀察框罩住，適應20 min后，應用390型足底輻射熱痛覺測試儀檢測熱痛閾。光強度刺激設定為40%，聚光光源從下方直接照射左側后爪足底，記錄由照射到大鼠左后肢縮腳的時間，即PWL。每天測量5次，每次測試間隔10 min，單次光照射時間不超過20 s，以免造成熱輻射損傷。去掉最大及最小值后，取3次的平均值作為后肢PWL。②回縮壓力閾值(PWPT):大鼠造模后第8、16、24、30天采用觸痛覺測試儀測定PWPT。將大鼠放在金屬網上，用有機玻璃觀察框罩住，適應20 min后，用尼龍絲從金屬網下方持續加壓，刺激大鼠左側足底，直至引起大鼠縮爪或甩足，讀取觸覺測試儀上的壓力值，即PWPT。每天測量5次，每次測試間隔10 min，去掉最大及最小值后，取3次的平均值作為PWPT。

1．2．3 滑膜組織學及行為學觀察 腹腔注射氯胺酮麻醉大鼠，沿左側后腿膝關節正中縱行切開皮膚，暴露以膝關節為中心約3 cm×3 cm的區域，沿髕骨上緣0．3～0．4 cm處向下切割直至髕骨，再沿髕骨兩側向下分離至脛骨，可見由髕骨下端向下延續有一層平滑光亮呈淺淡黃色的滑膜組織。用眼科鑷鈍性分離關節囊的滑膜層和纖維層，完整剝離滑膜組織，眼科鑷夾住中央，最后用眼科剪完整剪下，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。取大鼠滑膜，用RIPA裂解緩沖液提取滑膜總蛋白后變性-80℃保存。按照ELISA試劑盒說明書檢測滑膜組織中TNF-α的表達。

1．2．4 統計學方法 采用SPSS16．0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，多組均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 各組PWL、PWPT比較 造模第8、16天，正常組PWL與其他各組比較P均＜0．01，青藤堿組、甲氨蝶呤組與模型組比較P均＞0．05;第24天青藤堿組與模型組比較P＜0．05，甲氨蝶呤組與模型組比較P＜0．01;第30天青藤堿組與模型組比較P＜0．05，而甲氨蝶呤組與模型組比較 P＜0．01。見表1。造模后第8天正常組PWPT與其他各組相比P均＜0．01，其他各組間無差異;第16天正常組與其他各組比仍P＜0．01，甲氨蝶呤組與模型組比較P＜0．01。見表2。

2．2 各組滑膜組織學檢查結果比較 與正常組細胞相比，模型組滑膜上皮細胞明顯增生，滑膜中彌漫炎性細胞浸潤及纖維細胞增生，并有生發中心形成;青藤堿組滑膜上皮細胞增生較模型組模型減少且僅散在炎性細胞浸潤;甲氨蝶呤組滑膜上皮細胞增生較模型組明顯減輕，僅有散在炎性細胞浸潤及較少量纖維組織增生。見圖1。

表1 各組 PWL比較(s±s)

表1 各組 PWL比較(s±s)

注:與正常組比較，*P ＜0．01;與模型組比較，#P ＜0．05，##P ＜0．01

組別 n PWL第8天 第16天 第24天 第30天正常組 10 55．63 ±5．79 53．99 ±10．35 54．62 ±9．51 58．23 ±4．69模型組 10 21．82 ±6．91* 24．28 ± 3．30* 26．75 ±5．45* 27．64 ±6．55*青藤堿組 10 22．33 ±4．55* 30．39 ± 4．97* 34．16 ±7．38*# 43．91 ±7．84*##甲氨蝶呤組 10 26．31 ±6．14* 33．52 ± 8．72*## 37．14 ±8．85## 44．29 ±9．26*##

表2 各組PWPT比較(g±s)

表2 各組PWPT比較(g±s)

注:與正常組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與模型組相比，#P ＜0．05，##P ＜0．01

組別 n PWPT第8天 第16天 第24天 第30天正常組 10 10．57 ±2．05 10．93 ±1．61 10．78 ±2．34 11．62 ±2．03模型組 10 4．63±1．62＊＊ 5．08 ±1．99＊＊ 5．68 ±2．42＊＊ 5．76 ±2．02＊＊青藤堿組 10 4．82±1．94＊＊ 6．49 ±1．64＊＊ 8．17 ±1．44*# 8．69 ±2．36＊＊#甲氨蝶呤組 10 5．41±1．49＊＊ 5．61±1．59＊＊ 8．59±2．52*## 9．12±2．09*##

圖1 各組大鼠滑膜病理形態(200倍光鏡)

2．3 各組滑膜中TNF-α含量比較 正常組、模型組、青藤堿組、甲氨蝶呤組滑膜中TNF-α含量分別為(17．28 ± 4．97)、(71．71 ± 14．63)、(33．63 ±11．48)、(17．28 ±4．97)pg/mL，與正常組比較，模型組滑膜中TNF-α含量顯著升高(P＜0．01)。藥物干預后，甲氨蝶呤組TNF-α較模型組顯著降低(P＜0．01)，而與正常組比較無統計學差異(P＞0．05)。

3 討論

RA是一種累及周圍關節為主的系統性炎癥性自身免疫性疾病，主要表現為慢性、對稱性、進行性、侵襲性的多關節炎，滑膜的慢性炎癥、增生逐漸形成血管翳，侵犯關節軟骨、骨和肌腱等，最終導致關節疼痛、軟骨及骨破壞，形成關節畸形和功能喪失［3］。RA多見于中年女性，其具體發病機制尚不完全清楚，當前的研究主要圍繞感染因子展開。RA的主要病理改變是滑膜炎，炎性細胞滲出和浸潤以及滑膜細胞增生導致慢性炎癥性關節疼痛和壓痛是RA最早的臨床表現，抑制滑膜炎癥進展、減輕關節疼痛對提高RA患者的生活質量有重要意義。TNF-α主要由單核—巨噬細胞分泌，是一種促炎性細胞因子，能夠對炎癥、感染和其他應激產生影響，引起廣譜的生物效應，在免疫反應和炎癥中起重要作用。目前認為，TNF-α可通過3條信號通路來實現其生物功能，即細胞凋亡信號通路、核轉錄因子NF-κB信號通路、促分裂原活化蛋白激酶信號通路，而TNF-α刺激NF-κB信號傳導和JNK信號傳導在RA的發病機制中起關鍵作用［4，5］。

中藥青風藤為防己科植物青藤和毛青藤的干燥藤莖，味苦，性平，歸肝脾經，具有祛風濕、鎮痛之功效，用于治療風濕痹痛和關節腫痛。明代李時珍的《本草綱目》中有“青風藤治風濕流注，歷節鶴膝，麻痹瘙癢，損傷瘡腫”的記載。鹽酸青藤堿是從中藥青風藤中提取的生物堿單體，具有鎮痛抗炎、鎮靜、免疫抑制、抑制軟骨破壞等作用，廣泛用于治療RA和神經痛等。藥理研究顯示，青藤堿是很強的組織胺釋放劑，具有鎮咳麻醉、降血壓、免疫抑制等作用［1］。Zhou 等［6］發現，SIN 抑制膠原誘導的關節炎大鼠血清中TNF-α表達升高。Pang等［7］發現，青藤堿可抑制佐劑性關節炎大鼠巨噬細胞和滑膜細胞NF-κB活性，從而降低TNF-α表達。青藤堿在 RA治療中發揮的抗炎鎮痛作用主要與其抑制炎性細胞因子的表達有關。研究表明，各種細胞因子參與了RA的發病和演變，TNF-α、IL-1等炎性因子不但參與初始免疫應答，更通過抗原提呈細胞的作用參與免疫細胞活化，誘導金屬蛋白酶產生，促進關節破壞，從而導致RA的慢性進展。張瑩等［8］在體外實驗中觀察不同劑量青藤堿對TNF-α、IL-1表達的影響及對NF-κB轉錄活性的影響，證實青藤堿可抑制RA大鼠中 NF-κB的轉錄活性及減少 TNF-α、IL-1的mRNA表達。Wang等［9］通過實驗觀察到，青藤堿可以顯著改善大鼠關節腫脹度，降低大鼠關節炎指數，減少血清中IL-1β及IL-6表達，進而抑制基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表達，證實了青藤堿對佐劑性關節炎的治療作用。Chen等［10］觀察了青藤堿對RA患者滑膜成纖維細胞中TNF-α通路介導的血管黏附分子及趨化因子的表達，為青藤堿治療RA提供了體外實驗依據。本研究結果顯示，青藤堿可緩解大鼠關節疼痛，與文獻［11］報道一致。考慮其機制與青藤堿抑制 TNF-α的表達相關。TNF-α通過與特異性受體結合激活膠質細胞和神經元，誘發疼痛產生［12］，因此減少TNF-α表達可緩解關節炎的關節疼痛。

總之，青藤堿在減輕關節炎癥狀及疼痛中的作用確切，是臨床上治療RA的有效藥物之一，但其具體的作用機制仍值得進一步研究。

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