欖香烯乳對乳腺癌細胞株MDA-MB-231及MCF-7凋亡的影響

殷玉琨，宋愛莉，孫子淵

(1山東中醫藥大學，濟南250014;2山東中醫藥大學附屬醫院)

乳腺癌的發病率居女性惡性腫瘤的首位，且不斷上升，并有年輕化趨勢，嚴重危害婦女健康。雖然近年來其治療已取得長足進展，但一些惡性程度較高的類型及復發轉移的晚期患者預后較差。其中三陰性乳腺癌發病率約占乳腺癌所有類型發病率的17．27%［1］，且由于其生物學特性，對內分泌治療不敏感［2］。尋找有效的治療藥物是目前研究的熱點之一。欖香烯乳系中藥莪術提取物，是我國具有獨立產權的抗癌新藥，對肺癌、肝癌、食管癌、鼻咽癌和婦科腫瘤等多種惡性腫瘤的體內、外增殖具有抑制作用［3，4］，并可以增強臨床多種抗癌藥物的療效，降低放化療的毒副反應［5，6］;臨床上主要用于介入、腔內化療及癌性胸腹水的治療［7，8］，具有良好的應用前景。但目前關于欖香烯乳作用于乳腺癌的效果及機制的研究較少。我們既往研究表明，莪術油(其主要抗腫瘤成分為欖香烯乳)可以降低乳腺癌及癌前病變造模大鼠成瘤率、腫瘤組織血管生成，促進腫瘤細胞凋亡等［9，10］。2012年7 月 ～2013 年 1 月，我們在既往研究的基礎上，觀察欖香烯乳對乳腺癌細胞株生長及凋亡的影響，以探索欖香烯乳抗乳腺癌的機制。

1 材料與方法

1．1 材料 選用 ER、PR、HER-2均陰性的高侵襲乳腺癌細胞系MDA-MB-231及ER陽性、PR陽性、HER-2陰性的低侵襲乳腺癌細胞系MCF-7(英國卡迪夫大學外科系實驗室惠贈)。欖香烯乳注射液(100 mg/20 mL)購自大連華立金港藥業有限公司(批號:1207161)，胎牛血清和DMEM/Ham's F12購自PAA Laboratories公司，Tri-reagent試劑、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及GAPDH 的Q-PCR引物均購自Sigma公司。

1．2 方法

1．2．1 MDA-MB-231及MCF-7細胞系的培養 用含10%胎牛血清和DMEM/Ham's F12培養液在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養細胞，選用對數生長期細胞進行實驗。

1．2．2 結晶紫法檢測細胞生長速率［11］將對數生長期的MDA-MB-231及MCF-7細胞接種于96孔板，每孔種2 000個細胞(200μL)，每組重復5孔，重復3板，分別標記“0 h”、“48 h”和“96 h”。分別設空白對照組，及不同濃度的欖香烯乳處理組。空白對照組加入欖香烯乳的普通培養基，欖香烯乳處理組分別加入終濃度含10、20、40、80、160 μg/mL 的欖香烯乳注射液的培養基。放入孵育箱培養(37℃、5%CO2、飽和濕度)，于種植后第 1 天(0 h)、第3天(48 h)、第4天(96 h)分別取出，去掉培養液，加入4%甲醛固定過夜，0．5%結晶紫染色10 min后沖洗晾干，10%醋酸溶液溶解后，置于540 nm分光光度計(BIO-TEK，ELx800)讀取吸光值(OD值)。細胞生長速率表示為(OD48h或 OD96h－OD0h)/OD0h×100%。細胞抑制率表示為(1－OD處理組/OD對照組)×100%。實驗重復3次。應用藥物濃度計算軟件(LOGIT法)計算中位抑制濃度(IC50)。

1．2．3 RNA提取及cDNA逆轉錄［12］標記培養瓶MDA-MB-231或 MCF-7空白對照、欖香烯乳處理組，分別種植對數生長期的細胞1×106于培養瓶中，加入普通培養基孵育過夜(37℃、5%CO2、飽和濕度)。待細胞貼壁后，分別換入新鮮普通培養基或含40μg/mL欖香烯乳的培養基，培養48 h，顯微鏡下拍照記錄細胞形態。Tri-reagent試劑提取細胞RNA，質量檢測后，逆轉錄獲取cDNA。

1．2．4 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 檢測 采用Q-PCR法［13］。分別取欖香烯乳處理后的及空白對照的MDA-MB-231細胞的cDNA，分別制備Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 及 GAPDH 的 Q-PCR 反應液，應用 Icycler IQ5 system(Bio-Rad，Hammel Hemstead，UK)Real-time PCR系統獲取不同組間的Caspase及內參GAPDH的表達值。引物序列如下:Caspase-3正向引物為5'-GGCGTGTCATAAAATACCAG-3'，反向引物為5'-ACTGAACCTGACCGTACAACAAAGCGACTGGATGAA-3';Caspase-8正向引物為5'-AGAAAGGAGGAGATGGAAAG-3'，反 向 引 物 為5'-ACTGAACCTGACCGTACAGACCTCAATTCTGATCTGCT-3';Caspase-9正向引物為5'-AAGCCCAAGCTCTTTTTC-3'，反向引物為5'-ACTGAACCTGACCGTACAGTTACTGCCAGGGGACTC-3';GAPDH正向引物為5'-CTGAGTACGTCGTGGAGTC-3'，反向引物為5'-ACTGAACCTGACCGTACACAGAGATGACCCTTTG-3'。反應條件如下:95℃15 min預變性，然后按95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s(共60個循環)，最后72℃10 min延伸。反應結束后確認Real-time PCR的擴增曲線和融解曲線，并對結果進行分析:相對定量=目的基因的表達×內參基因表達的修正比值。

1．2．5 統計學方法 采用SPSS13．0統計軟件。所有實驗均重復3次以上，實驗結果采用ˉx±s表示，計量資料的組間比較采用t檢驗。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 欖香烯乳對細胞生長速率的影響 分別用不同終濃度的欖香烯乳處理細胞48、96 h后，與對照組(0μg/mL)比較，欖香烯乳濃度達到一定劑量時，細胞的生長速率明顯下降，且呈時間—劑量依賴性。48 h時對MDA-MB-231細胞的IC50為58μg/mL，對MCF-7細胞的IC50為148μg/mL。見表1。

2．2 欖香烯乳對細胞形態的影響 終濃度為40 μg/mL的欖香烯乳培養基處理 MDA-MB-231和MCF-7細胞48 h后，與對照組比較，應用欖香烯乳的細胞由黏附狀態變圓，細胞核固縮、崩解，可見凋亡小體，呈現典型的細胞凋亡表現。見插頁Ⅰ圖1。2．3 欖香烯乳對MDA-MB-231細胞Caspase表達的影響 空白對照組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 表達量(×107拷貝量)分別為56．7 ±15．7、140．3±25．6、13．1 ±4．4，經欖香烯乳處理后分別為812．2±222．6、327．8 ±50．1、5．7 ±1．5，與空白對照組比較，經欖香烯乳處理后Caspase-3、Caspase-8表達量升高(P均＜0．05)，Caspase-9表達量無明顯變化(P＞0．05)。

表1 欖香烯乳對細胞生長速率的影響(%±s)

表1 欖香烯乳對細胞生長速率的影響(%±s)

注:與0 μg/mL 比較，*P ＜0．05，△P ＜0．01

欖香烯乳MDA-MB-231 MCF-7 48 h 96 h 0μ 48 h 96 h g/mL 252±13 641±11 404±50 1 022±111 10μg/mL 271± 9 624±29 451±64 1 178±100 20μg/mL 254± 9 540±29* 435±54 1 200± 96 40μg/mL 214±15 557±17△ 400±33 1 074± 51 80μg/mL 48±12△ 160±27△ 326±41 897± 69 160μg/mL －25± 5△ －45± 6△ 181±34* 277±137△

3 討論

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，目前以手術、化療、放療的綜合治療為主，但仍有復發轉移的治療失敗者，尤其三陰性乳腺癌對內分泌治療不敏感，且目前缺乏相應的靶向治療藥物。欖香烯乳作為Ⅱ類非細胞毒性抗腫瘤藥，具有化療增敏、逆轉腫瘤多藥耐藥和提高機體免疫功能等多重作用，且不良反應較輕，因而在乳腺癌的臨床治療上有良好的應用前景。經文獻檢索，既往已進行了欖香烯乳對多種惡性腫瘤的體內及體外實驗，但針對欖香烯乳治療三陰性乳腺癌的效果及機制的報道較少。

既往研究證明，欖香烯乳可抑制多種腫瘤細胞的生長，誘導其凋亡是其主要的途徑之一。本研究選擇ER陽性、PR陽性、Her-2陰性的低侵襲性細胞株MCF-7及ER、PR、Her-2均陰性的高侵襲性細胞株MDA-MB-231，采用欖香烯乳進行干預觀察其對MDA-MB-231細胞生長速率及凋亡誘導的影響。實驗結果表明，當欖香烯乳達到一定濃度時，可抑制乳腺癌細胞的生長，且呈濃度依賴性;相對于低侵襲性的MCF-7細胞系，對高侵襲性MDA-MB-231細胞系的抑制作用更為明顯;經過欖香烯乳處理后，兩種細胞系均呈現出細胞凋亡的形態特征;針對欖香烯乳作用后的MDA-MB-231細胞凋亡因子的檢測顯示，欖香烯乳可能是通過誘導了乳腺癌細胞的凋亡從而達到抑制其生長的作用。

細胞凋亡亦稱程序性細胞死亡，是一種受遺傳學機制調控的為維持內環境穩定的細胞自殺過程。現代腫瘤學認為，逃避免疫監視是腫瘤發生與發展的重要機制之一。隨著對腫瘤細胞凋亡研究的深入，科研人員發現細胞凋亡在腫瘤免疫逃逸中起著重要作用。越來越多的實驗證實，Caspases在細胞凋亡調節過程中起關鍵作用［14］。細胞凋亡受到嚴格調控，在正常細胞Caspase處于非活化的酶原狀態，凋亡程序一旦開始，Caspase被激活，隨后凋亡蛋白酶的層疊級聯反應以不可逆的形式發生。目前，已經發現 Caspase家族至少有14個成員，其中Caspase-2、8、9、10、11 主要負責對執行者的前體進行切割，從而產生有活性的執行者;Caspase-3、6、7主要負責切割細胞核內、細胞質中的結構蛋白和調節蛋白。細胞凋亡的途徑有死亡受體路徑、線粒體路徑等。在死亡受體路徑中，Caspase-2、8被激活，最終激活其效應器酶(通常Caspase-3)而導致細胞死亡［15］;在線粒體路徑中，Caspase-9被激活，然后激活下游的效應 Caspase 如 Caspase-2、3、6、7、8、10，啟動Caspase的級聯反應，引起細胞凋亡［16］。本研究中，經欖香烯乳處理后的 MDA-MB-231細胞Caspase-3、Caspase-8上調，而Caspase-9與對照組比較無統計學差異，提示欖香烯乳誘導的乳腺癌細胞凋亡，可能是通過死亡受體路徑引起的。

綜上所述，欖香烯乳抑制乳腺癌細胞的生長速率，其可能機制是通過激活死亡受體途徑誘導了細胞的凋亡。本次實驗結果為后續研究提供了良好的前期基礎，同時也為臨床選擇三陰性乳腺癌治療方案提供了一些思路及實驗支持。

［1］Swain SM．Triple-negative breast cancer:meta-static risk and role of platinum agents［C］．44th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology，2008:30．

［2］廖仕翀，喻莉，李金芯，等．三陰性乳腺癌的臨床特點及治療進展［J］．中華乳腺病雜志(電子版)，2012，6(1):56-59．

［3］Jianjun Q，Song Z，Yin L，et al．Treatment of chylothorax with elemene［J］．Thorac Cardiovasc Surg，2008，56(2):103-105．

［4］Wang B，Peng XX，Sun R，et al．Systematic review of beta-elemene injection as adjunctive treatment for lung cancer［J］．Chin J Integr Med，2012，18(11):813-823．

［5］肖震宇，劉華峰，鄧江華．欖香烯注射液聯合放療治療肺癌腦轉移的療效及對血清基質金屬蛋白酶-2和-9的影響［J］．中國老年學雜志，2012，32(15):3209-3210．

［6］張叢梅．欖香烯單藥或聯合放化療治療腦惡性腫瘤的分析［J］．亞太傳統醫藥，2012，8(3):66-67．

［7］孫魯江，王乃東．肝動脈灌注并瘤體內注射欖香烯-碘油乳劑治療肝癌40 例［J］．中國實用醫藥，2012，7(22):166-167．

［8］王晉舜．腹腔內注射欖香烯乳與雙通路化療聯合治療癌性腹水臨床觀察［J］．中國實用鄉村醫生雜志，2012，19(4):51-52．cal significance［J］．JTransl Med，2011(9):95．

［13］Yu H，Ye L，Mansel RE，et al．Clinical implications of the influence of Ehm2 on the aggressiveness of breast cancer cells through regulation of matrix metalloproteinase-9 expression［J］．Mol Cancer Res，2010，8(11):1501-1512．

［14］李超，伏圣博，劉華玲，等．細胞凋亡研究進展［J］．世界科技研究與發展，2007，29(3):45-53．

［15］李小艷，包素珍．Caspase家族的研究進展［J］．內蒙古中醫藥雜志，2012(2):107．

［16］戴昕，李占全，冀林華．凋亡相關蛋白Caspase研究進展［J］．中國現代醫藥雜志，2010，12(4):130-132．