川崎病易感性及冠狀動脈損害與PD-1rs41386349多態性的關系

姜亞男，張宏艷，林書祥

(1天津醫科大學，天津300070;2天津市兒童醫院)

川崎病(KD)又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征(MCLS)［1］，是一種主要發生在5歲以下嬰幼兒的急性發熱出疹性疾病，其病理學特點為系統性血管炎，主要累及中等大小的肌性動脈，以冠狀動脈損害最為常見。目前，KD已經取代風濕熱成為最常見的兒童獲得性心臟病［2～4］。流行病學資料提示，KD具有一定的遺傳易感性［5，6］。程序性凋亡基因-1(PD-1)rs41386349與 KD 的發生顯著相關［7］，PD-1可能是KD的遺傳易感基因。本研究旨在探討KD易感性及冠狀動脈損害與PD-1rs41386349多態性的關系。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 KD組:2010～2012年于天津市兒童醫院就診的典型KD患兒25例，男15例、女10例，年齡(2．07±1．80)歲，均為漢族，均符合 KD 的診斷標準［8］，丙種球蛋白治療均敏感。參照美國心臟協會及日本衛生部的KD并冠狀動脈損害診斷標準［9］，將患兒分為冠狀動脈損害組(12例)和無冠狀動脈損害組(13例)。對照組:20例漢族健康兒童，男12例、女8例，年齡(9．38±2．59)歲，均無自身免疫性疾病及相關家族史。研究對象均簽署知情同意書。

1．2 方法

1．2．1 PD-1rs41386349檢測方法 采用 RT-PCR方法。采用DNA提取試劑盒(PROMEGA#A7710，PROMEGA公司)分別抽提各組外周全血細胞DNA;利用上游引物5'-ACGGCCTGCAGGACTCAC-3'及下游引物 5'-AGGCAGGCACATATGTG-3'，通過聚合酶鏈式反應，按照以下條件進行擴增:96℃預變性3 min，95 ℃變性1 min、56 ℃復性1 min、72 ℃延伸1 min(33個循環)，72℃延伸7 min;并設置陰性對照。擴增片段長225 bp。取符合要求的PCR擴增產物送生工生物工程(上海)有限公司，進行純化測序。將測序結果在美國國立生物技術信息中心網站上，用比對生物序列一級結構的BLAST算法進行序列比較及分析。對于測序結果不十分明確的樣本，進行反向測序，進一步驗證后方可納入統計。

1．2．2 統計學方法 采用SPSS17．0統計軟件。采用χ2檢驗分析各組基因型數據的遺傳平衡;采用χ2檢驗與Fisher確切概率法，比較KD組與非KD組、KD組中合并冠狀動脈損害與未合并冠狀動脈損害者中PD-1rs41386349等位基因頻率與基因型頻率。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 PD-1rs41386349的電泳及基因測序結果 見圖 1、2。

圖1 PD-1rs41386349的電泳圖

圖2 PD-1rs41386349基因型測序圖

2．2 各組PD-1rs41386349等位基因和基因型頻率比較

2．2．1 KD組和對照組PD-1rs41386349等位基因/基因型頻率比較 KD組PD-1rs41386349等位基因/基因型 C、T、CC、CT、TT 的數目分別為 21、29、5、11、9，對照組中的數目分別為 29、11、11、7、2;KD 組中T等位基因頻率明顯高于對照組(P=0．004)，其中CT和TT基因型的OR值均＞1，而CC基因型頻率的OR值＜1，說明T等位基因可能是KD的致病基因，而C等位基因對于KD可能是一個保護性基因。

2．2．2 冠脈損害組和無冠脈損害組KD患兒PD-1rs41386349等位基因/基因型頻率比較 冠脈損害組 KD 患兒等位基因/基因型 C、T、CC、CT、TT 的數目分別為11、13、2、7、3，無冠脈損害組中的數目分別為10、16、3、4、6，兩組各基因型與等位基因頻率比較，P 均 ＞0．05。

3 討論

KD是一種自身免疫性全身脈管炎癥性疾病，該病在急性期存在明顯的免疫失調。而PD-1基因作為一種免疫開關存在于多種自身免疫性疾病中。最近的研究表明，PD-1基因是在T細胞活化后被誘導產生的，當PD-1基因與其配體1、2結合后，可以反作用于T細胞，抑制T細胞的繼續活化并加速免疫細胞的凋亡，從而抑制免疫反應的發生［10，11］。PD-1基因有缺陷的兒童即使免疫反應達到頂峰，PD-1基因也不能發揮其免疫負性調節作用，致使T淋巴細胞被無限制激活，機體免疫失衡，這正是KD急性期的一個重要特點。

本研究將焦點集中于免疫開關，免疫開關是感染后機體由正常的免疫應答向自身性免疫反應轉變過程中導致KD發生的一個關鍵因素。本研究首次對中國漢族兒童PD-1rs42386349等位基因/基因型頻率進行調查，并分析了該位點單核苷酸多態性與KD的相關性。結果表明，KD組與對照組中PD-1rs41386349的等位基因頻率與基因型頻率比較，差異均有統計學意義;但是，KD組中合并冠狀動脈損害與未合并冠狀動脈損害的患者之間，PD-1rs41386349的等位基因頻率與基因型頻率比較無統計學差異。

研究發現，10% ～20%的KD患兒出現復發或對大劑量的免疫球蛋白沖擊療法出現耐藥。對于這樣的患病人群，可采用一種新的治療方法，即通過激活PD-1基因使之與其配體1、2結合從而抑制T細胞的活化，發揮免疫負性調節作用，使得機體處于免疫平衡狀態，阻止全身性脈管炎的發生［11，12］。但PD-1信號廣泛存在且關系復雜，這種治療模式可能帶來許多不良反應，如何處理有待進一步研究。

綜上所述，我們認為PD-1rs41386349與中國兒童KD的發生存在相關性，然而，PD-1rs41386349與KD患兒是否合并冠狀動脈損害無明顯相關性。但是，由于研究對象、人種等因素的不同，可能會影響研究結果，因此還需要在樣本量足夠、病例選擇多樣化等前提下，進行多中心的臨床對照研究。此外，至今已發現KD與多個遺傳易感基因相關，PD-1基因多態性只能與一部分KD發病相關。因此，我們還需要對整個KD遺傳易感基因網絡進行分析、總結，從而找出其關鍵作用的基因進行研究，以進一步明確KD的發病機制，為開展KD的個體化預防、治療提供新的理論依據。

［1］Kawasaki T．Acute febrile mucocutaneous syndrome with lymphoid involvement with specific desquamation of the fingers and toes in children［J］．Arerugi，1967，16(3):178-222．

［2］Fimbres AM，Shulman ST．Kawasaki disease［J］．Pediatr Rev，2008，29(9):308-316．

［3］Du ZD，Zhang T，Liang L，et al．Epidemiologic picture of Kawasaki disease in Beijing from 1995 through 1999［J］．Pediatr Infect Dis J，2002，21(2):103-107．

［4］賈雷，孫毅平，韓波．川崎病患兒冠狀動脈損害危險因素分析［J］．山東醫藥，2011，51(50):62-63．

［5］Onouchi Y，Gunji T，Burns JC，et al．ITPKC functional polymorphism associated with Kawasaki disease susceptibility and formation of coronary artery aneurysms［J］．Nat Genet，2008，40(1):35-42．

［6］Okazaki T，Honjo T．PD-1 and PD-1 ligands:from discovery to clinical application［J］．Int Immunol，2007，19(7):813-824．

［7］Kuo HC，Chang WC．Genetic polymorphisms in Kawasaki disease［J］．Acta Pharmacol Sin，2011，32(10):1193-1198．

［8］Newburger JW，Takahashi M，Gerber MA，et al．Diagnosis，treatment，and long-term management of Kawasaki disease:a statement for health professionals from the Committee on Rheumatic Fever，Endocarditis，and Kawasaki Disease，Council on Cardiovascular Disease in the Young．American Heart Association［J］．Pediatrics，2004，114(6):1708-1733．

［9］Tsuda E，Matsuo M，Naito H，et al．Clinical features in adults with coronary arterial lesions caused by presumed Kawasaki disease［J］．Cardiol Young，2007，17(1):84-89．

［10］Uehara R，Yashiro M，Nakamura Y，et al．Clinical features of patients with Kawasaki disease whose parents had the same disease［J］．Arch Pediatr Adolesc Med，2004，158(12):1166-1169．

［11］Francisco LM，Sage PT，Sharpe AH．The PD-1pathway in tolerance and autoimmunity［J］．Immunol Rev，2010(236):219-242．

［12］Kuo HC，Yang KD，Chang WC，et al．Kawasaki disease:an update on diagnosis and treatment［J］．Pediatr Neonatol，2012，53(1):4-11．