微生物全自動儀器聯合快速檢測兒童血液致病菌的分析

唐之儉

（上海市中山醫院青浦分院，上海 201700）

微生物全自動儀器聯合快速檢測兒童血液致病菌的分析

唐之儉

（上海市中山醫院青浦分院，上海 201700）

目的 針對探討兒童血培養的細菌檢測和鑒定的快速方法。方法 用法國生物梅里埃公司提供的兒童專用血培養瓶 PF，經 BacT/ Alert3D 儀檢測生長細菌的陽性標本，從中提取菌體后，直接用 WALKAWAY96/PIUS 自動化儀器儀進行細菌鑒定 ( 直接法 )，同時轉種培養基平板，用分純的菌落進行自動化儀器法的細菌鑒定 (標準法 )，比較兩法的符合率。結果 直接法共鑒定了 50 份模擬標本和 42 份臨床血液標本的細菌，與標準法對照，模擬標本 50 份，革蘭陰性桿菌總符合率 88.28%，革蘭陽性球菌符合率為 80.00%，總符合率為88.00%。臨床標本 42 份，革蘭陰性桿菌總符合率 90.48%，革蘭陽性球菌符合率為 80.92%，總符合率 80.90%。 結論 聯合應用 BacT/ Alert3D 儀和 WALKAWAY 自動化儀器儀，可以縮短血液培養的細菌檢測和鑒定時間。直接法鑒定革蘭陰性的腸桿菌科細菌，結果滿意。

兒童血液培養；細菌鑒定；全自動分析

隨著自動化、計算機在近年的發展，原先的手工和半自動化血液培養方法發展成全自動儀器檢測，這一變化的結果使陽性率得到了提高、檢測時間得到減少[1-2]。中山青浦分院檢驗科微生物室使用了BacT/Alert3D全自動血培養系統檢測出血液中細菌生長情況，在此基礎上，用菌體直接進行了WALKAWAY自動化儀器法的細菌鑒定（這些細菌是從被檢驗出是陽性的標本中提取出來的），然后，把這這些鑒定結果和利用分純的細菌進行WALKAWAY自動化儀器法的細菌鑒定結果做了比較，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

①標準菌株：金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）：大腸埃希菌（ATCC 25922）、糞腸球菌（ATCC29212）購自衛生部上海市臨床檢驗中心。②已知菌株：總共是50份，包括46份來自臨床標本中分離鑒定后保存的菌株和4份上海市臨床微生物室間質評下發的標準菌株。

1.1.2 標本的來源

①模擬標本：它是已知菌株和標準的菌株聯合制成的；總數為50株。②臨床標本：為我院2011年1月1日至2012年4月1日期間，兒科門診以及病房懷疑菌血癥兒童（年齡在14歲內）的血液標本，總送檢標本為726份，經BacT/Alert 3D儀確定為陽性54份。陽性率為：7.57%。選取其中42株進行比較鑒定。

1.1.3 儀器

全自動血培養系統（BacT/Alert 3D 120）法國生物梅里埃；全自動微生物鑒定系統（WALKAWAY96/PLUS自動化儀器）美國西門子診斷。

1.1.4 培養基

血培養瓶為BacT/Alert配套專用的兒童專用瓶（PF），具中和抗生素功能。細菌鑒定藥敏板為WALKAWAY自動化儀器儀器配套專用的革蘭陰性菌板NC31和革蘭陽性菌PC20。血平板，麥康凱平板和巧克力平板為上海科瑪嘉生物技術有限公司生產。

1.1.5 無菌試管

北京金山川科技發展有限公司提供 BD醫療器械有限公司生產的一次性無熱源真空塑料管。

1.2 方法

1.2.1 模擬標本的制備

經過了復蘇傳代后的已知菌株和標準菌株，把它們制成菌液，濃度0.5McFarland，把梯度稀釋后濃度為101CFU/mL的菌液加入有5mL正常人靜脈血液培養瓶中，最后，把培養瓶放在BacT/Alert系統內進行檢測。

1.2.2 BacT/Alert3D陽性瓶的檢出與標本處理

將已經接種的臨床標本和模擬標本的培養瓶放入BacT/Alert系統后，輸入相關的資料，系統就會自己完成孵育、檢驗和結果的保存與報告。系統會在瓶中檢驗出細菌生長時發生響聲警報。抽取一些培養液，涂片行革蘭染色，同時，將麥康凱平板、巧克力平板和血平板和它接種。再把另外的10mL培養液放在高溫高壓處理后的無菌試管中，經過150×g離心5min，上清收集2mL，放在BD無菌試管中，再經過5min的150×g離心，取出沉淀，經2次無菌鹽水洗滌離心，將菌細胞收集。

1.2.3 鑒定細菌的直接WALKAWAY自動化儀器方法(直接法)

將離心制備的菌細胞，用配套鹽水制成菌懸液（革蘭陰性桿菌為0.5 McFarland，革蘭陽性球菌為1.0 McFarland），接種WALKAWAY自動化儀器儀的NC31和PC20鑒定板。

1.2.4 鑒定細菌的標準法

將陽性瓶的標本轉移到培養基平板中，18～24h、35℃過夜孵育，提取純菌落。按WALKAWAY自動化的操作說明上機檢測。

1.2.5 解釋結果

標準法和直接法鑒定的細菌名字是一樣的，而且，鑒定率的可信度≥80%，認為這兩種方法的結果是符合的。

2 結 果

經BacT/Alert全自動血培養系統檢測出的陽性標本也經過了WALKAWAY全自動微生物鑒定藥敏系統標準法和直接法的細菌鑒定試驗。模擬標本50份，革蘭陰性桿菌總符合率88.28%，革蘭陽性球菌符合率為80.00%，總符合率為88.00%。臨床標本42份，革蘭陰性桿菌總符合率90.48%，革蘭陽性球菌符合率為71.48%，總符合率80.90%。詳見表1。

3 討 論

這個實驗對臨床標本和模擬標本用了直接法來鑒定細菌，和標準法比較，臨床標本和模擬標本中鑒定革蘭陰性桿菌的符合率為90.48%和88.28%，都比革蘭陽性桿菌的71.48%和80.00%高。革蘭陰性桿菌的腸桿菌科細菌符合率高，它在臨床標本和模擬標本的鑒定符合程度都極高。因為很多鏈球菌和非發酵菌在鑒定卡中有不少的陰性反應，生長并不充分，附加實驗不精確，所以此試驗結果并不理想，這需進一步探討。

表1 標準法和直接法鑒定細菌結果的符合情況

處理BacT/Alert 3D陽性瓶的標本，第一要做的就是進行圖片染色看看它是混合菌還是單一菌生長，混合菌要轉種到平板分離純菌株，而單一菌可以依據染色體的形態、性質用直接法在相應鑒定卡上鑒定，鑒定過程中，要將單一菌轉種到培養基平板，得到的純菌落再用于復核結果和實驗補充。從BacT/Alert陽性瓶中提取菌細胞的量與純度對用直接法鑒定細菌的結果、可信度、所用時間都至關重要，最初離心是為了除去培養液中吸附劑等有形成分，盡量讓它沉淀；抽取的培養液最少10mL，來確保有足夠的菌細胞。

菌血癥的主要病原菌是腸桿菌科細菌，占檢出菌的30%～40%[3,4]，結果表示，用BacT/Alert儀檢測血培養，腸桿菌科細菌能在24h內馬上檢出的占80%，加上直接法鑒定，比轉種培養平板少18～24h，用WALKAWAY自動化儀器儀鑒定的時間更短，8h內就可完成94.6%的腸桿菌科細菌，革蘭陽性球菌在13h內的完成比率是64.2%，非發酵菌是83.8%。

微生物鑒定和藥物敏感性測定對于臨床治療具有重要的意義，準確快速的藥敏測定已越來越成為臨床治療的迫切需求，微生物自動化儀器的應運而生就充分體現了這一優異的性能。WALKAWAY/ 96PLUS的高級專家系統是一種計算機化藥敏綜合分析程序，其功能具有：判斷藥敏表型和鑒定菌種是否一致，在不一致時提出修改意見或建議重新進行鑒定；根據藥敏結果分析可能存在的耐藥機制，并對藥敏結果進行修訂。因此大大提高了鑒定和藥敏結果作為臨床治療依據的準確性。

研究認為，聯合應用BacT/Alert3D和WALKAWAY自動化儀器系統，對經確定為陽性的血液培養標本，通過離心提取菌體直接用WALKAWAY自動化儀器儀鑒定細菌，能更快完成分析腸桿菌科細菌引起的菌血癥的病原學。尤其適用于兒童感染性疾病中血培養的快速檢測，為臨床兒科發熱，血流感染病患提供及時，準確的信息。

參考文獻

[1]崔巍.血培養850份結果分析[J].中華檢驗醫學雜志,2005,28(7):751.

[2]周惠平,王金良.臨床微生物學標本采集和處理的規范要求[J].中華醫學檢驗雜志,2000,23(5):312-314.

[3]中華醫學會檢 驗 醫學分 會.臨 床微 生物學血 培 養 操 作 規范[J].中華檢驗醫學雜志,2004,27(2):124-126.

[4]程彥國,張軍民,趙莉莉,等.全自動培養儀的臨床應用及評價[J].中華醫學檢驗雜志,1999,22(1):74.

R446.11

：B

：1671-8194（2013）05-0096-03