家蠅取食粗纖維后β－葡萄糖苷酶活性與基因表達量的變化

張 姝，胡 蓉，吳建偉，國 果，付 萍

(貴陽醫學院人體寄生蟲學教研室，貴陽 550004)

β－葡萄糖苷酶(β－Glucosidase，EC，3.2.1.21)是纖維素酶重要組成部分，能催化水解芳香基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖，可以消除纖維二糖對纖維素酶的負反饋作用，在農業副產品的降解、利用過程中發揮著關鍵作用(Anish et al.，2010;James et al.，2010)。關于昆蟲利用自身β－葡萄糖苷酶降解環境中纖維素以獲得生存所需能量的研究，國內外已有大量的報道。研究對象多以等翅目的白蟻(Nathan et al.，2011;曾文慧等，2012;Tokuda et al.，2012;劉瑞嫻等，2012)、鞘翅目的天牛和象鼻蟲(殷幼平等，2000;Yapi et al.，2004;Wei et al.，2006;索風梅等，2007)、鱗翅目的草地貪衣蛾(Marana et al.，2004)等為主。但對于分布廣泛，繁殖力超強，雜食類的家蠅Musca domestica卻未見相關報道。家蠅是生態系統中的分解者，在一定條件下，蠅蛆能夠食用高粱秸稈、稻草秸稈等農副產品下腳料為自身提供能量。本研究以家蠅為研究對象，用粗纖維含量不同飼料進行喂養，觀察家蠅不同生長發育時期的β－葡萄糖苷酶mRNA 表達水平和酶活性變化，探討食物中粗纖維含量對β－葡萄糖苷酶的影響。為揭示家蠅對自然界纖維素的生物轉化作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗昆蟲

家蠅由貴陽醫學院人體寄生蟲學教研室保存。養蠅房恒溫25℃，光周期12L∶12D，將家蠅分為3組，對照組以麥麩喂養，粗纖維含量為30%，實驗組1 用等量的高粱秸稈代替麥麩，粗纖維含量為40%，實驗組2 等量稻草秸稈替代麥麩，粗纖維含量為50%。

1.1.2 主要試劑

水楊苷(Sigma)，非干擾型蛋白濃度檢測試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，3，5－二硝基水楊酸(DNSA，Genview)，總RNA 提取試劑盒Trizol(Invitrogen)，Prime Script?One Step RT－PCR Kit、DNA maker、反轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、pMDTM18－T(TaKaRa)。

1.1.3 主要儀器

實時熒光定量PCR 儀(ABI7300)，凝膠成像系統(美國Bio-rad)，CT15RE 高速冷凍離心機(HITACHI)，752N 紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，μ-Quant 酶標儀(美國Bio-Tek)。

1.2 方法

1.2.1 飼料殘渣中粗纖維含量測定

按照中華人民共和國國家標準GB/T 5009.10－2003 方法，檢測對照組、實驗組1和實驗組2三種飼料殘渣中粗纖維含量，同時對比飼養后家蠅3齡幼蟲個體體重、體長以及幼蟲主要成分。家蠅幼蟲中粗脂肪、粗蛋白、粗纖維、水分、灰分和碳水化合物的含量檢測委托貴州師范大學分析測試中心(計量認證許可證:2009240425Z)依據中華人民共和國國家標準GB/T5009.3;.4;.5;.6;.10－2003 進行檢測。

1.2.2 家蠅樣品的采集

在對照組、實驗組1和實驗組2 中，按照文獻方法(張姝等，2013)，分別在家蠅不同發育階段(卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、蛹、成蟲)取樣，待用。

1.2.3 家蠅樣品總RNA 提取

將家蠅不同樣品采用Trizol 法提取樣品的總RNA，用酶標儀對提取的RNA 進行測定，計算OD260nm/OD280nm比值和RNA 濃度。總RNA 用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。采用DL2000 DNA maker 作為指示。

1.2.4 反轉錄cDNA

按照TaKaRa 試劑盒說明書進行操作，反應體系為:1 μg 總RNA，2μL 5×gDNA Eraser Buffer，1μL gDNA Eraser，用RNase Free ddH2O 定容至10μL，42℃2 min 后，加入4μL 5×Prime Script Buffer 2(for Real Time)，1μL Prime Script RT Enzyme Mix，1μL RT Primer Mix，4μL RNase Free ddH2O，37℃15 min，85℃5 s，－20℃保存備用。

1.2.5 RT－PCR

引物參照GenBank 上已發表的序列，采用primer 5 設計引物(跨內含子)，引物序列見表1。引物委托上海生工公司合成。50μL反應體系為:2μL Prime Script 1 step Enzyme Mix，25μL 2×1 step Buffer，1μL目的基因的上、下游引物，2μL Template RNA，19μL RNase Free ddH2O，ddH2O代替RNA 模板作為陰性對照。反應條件:50℃30 min;94℃2 min;94℃30sec，58℃30sec，72℃1 min，30個循環，終止延伸。擴增結束后，將5μL PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測和鑒定，用100bp DNA maker 作為指示。并用DNA凝膠回收試劑盒回收純化后。連接到pMDTM18－T，然后轉化E.coli DH5α 感受態細胞。進行藍斑篩選，挑取陽性克隆接種于LB 液體培養基，過夜培養后用質粒提取試劑盒抽提質粒DNA，將質粒送上海生工測序。

1.2.6 實時熒光定量PCR

25μL PCR反應體系:目的基因的上下游引物各1μL，cDNA 模板2μL，SYBR Premix EX TaqTMⅡ(2X)12.5μL，RNase Free ddH2O 8μL，ROX Reference Dye(50×)0.5μL。反應條件為:95℃30 s，95℃5 s，60℃30sec，40個循環。每一個樣品3個技術重復，每組做3個生物重復。每次PCR反應均設置陰性對照(ddH2O代替cDNA 模板)。采用比較2－△△CT法，對目標基因進行相對定量分析。

表1 PCR 的引物Table 1 The primers of PCR

1.2.7 DNSA 法檢測β－葡萄糖苷酶活性

1.2.7.1 粗酶液的制備

按0.15 g 樣品加入1mL 0.1 M 醋酸－醋酸鈉緩沖液(pH=5.6)，冰浴研磨，在12 000 rpm，4℃，離心10 min，取上清液即為纖維素酶的粗酶液，置于－80℃冰箱中待用。

1.2.7.2 粗酶液蛋白定量

采用BCA 蛋白濃度測定法進行測定(Smith et al.，1985)。取10μL 家蠅粗酶液和6種不同濃度的蛋白質標準溶液加入2mL 的BCA 工作液，在480 nm 波長處測定其吸收值，計算出粗酶液的蛋白濃度。

1.2.7.3 DNSA 法檢測家蠅β－葡萄糖苷酶酶活性

采用DNSA 法測定(Miller，1959)，在離心管中分別加入1% 水楊苷0.3mL 后加入粗酶液0.1mL，混勻后在50℃水浴條件下反應60 min，立即加入0.3mL DNSA 顯色劑終止反應，在沸水浴顯色5 min，冷卻至室溫后，用0.1 M 醋酸－醋酸鈉緩沖液定容至5mL。于紫外分光光度計測OD540值，每一個樣品3個生物重復，每組3個重復。每次酶活性實驗均設陰性對照(以緩沖液代替粗酶液)。從葡萄糖標準曲線計算葡萄糖含量。在pH 5.6、50℃反應60 min 的條件下，以每分鐘產生1 umoL 葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活性單位(IU)。纖維素酶活性大小用比活力(Willis et al.，2010)，即每mg 蛋白中的酶單位數量來表示。纖維素酶比活力(IU/mg)=(m×5.56)/(V×C×t)。m:產生的葡萄糖含量(mg);C:粗酶液蛋白濃度(mg/mL);V:反應液中加入的粗酶液體積(mL);t:反應時間(min)。

1.2.8 統計學分析

用SPSS11.5 軟件對相關數據進行統計學分析，組間比較用q 檢驗，P＜0.05 為有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 飼料殘渣中粗纖維含量測定

飼料殘渣中粗纖維測定結果顯示，對照組、實驗組1和實驗組2 粗纖維含量為12.93±0.85%和16.4±0.41%，17.43±0.28%。對照組、實驗組1和實驗組2 的粗纖維降解效率分別為29.569±0.02%，39.59±0.009 %，49.65±0.41%。

2.2 家蠅幼蟲的基本情況

由表2 可見，對照組和實驗組飼養的家蠅3齡幼蟲平均體重分別為26.7±1.2 mg、25.0±0.6 mg和26.3±0.8 mg，平均體長分別為11.7±0.7 mm、11.5±0.6 mm和12.1±0.7 mm，3 組間幼蟲平均體重和體長兩兩比較無顯著差異(P＞0.05)。3 組家蠅3齡幼蟲主要成分檢測情況見表2，實驗組1和實驗組2 的家蠅幼蟲所含的粗蛋白、粗脂肪和粗纖維含量都接近或大于麥麩飼養的家蠅幼蟲。

表2 家蠅3齡幼蟲主要成分比例Table 2 The main component ratio of the 3rd instar larvae from Musca domestica

2.3 RT－PCR 產物

將5 μLPCR 產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。結果表明，各模版擴增的內參基因GAPDH片段亮度相近，在209 bp 出現特異性條帶，與理論值一致，測序得到的核苷酸序列，與目標序列一致。陰性對照無擴增條帶出現。3 組各生長發育階段的家蠅β－葡萄糖苷酶基因在188 bp 處均出現了特異條帶(圖1)，大小與理論值一致，各條帶亮度存在差異。條帶亮度明暗順序為:卵＜1齡幼蟲＜2齡幼蟲＜齡幼蟲＜蛹＜雌蠅≤雄蠅。陰性對照無擴增條帶出現。

2.4 家蠅β－葡萄糖苷酶基因mRNA 表達水平

以GAPDH 基因作為內參，采用2－ΔΔCT法對不同組家蠅β－葡萄糖苷酶基因在家蠅各生長發育階段的表達差異進行分析(圖7)。在家蠅的6個生長階段中家蠅β－葡萄糖苷酶基因均有表達，表達量呈逐步增強趨勢(P＜0.05)，其中對照組、實驗組1和實驗組2 在成蟲期表達水平最高，較卵期分別上調了約19倍，22倍，25倍。在不同粗纖維含量3個組中，家蠅β－葡萄糖苷酶基因表達量兩兩比較有顯著差異(P＜0.05)，且實驗組2＞實驗組1＞對照組。實驗組1和實驗組2 在不同生長時期mRNA 表達水平較對照組分別提高了1.7～2.4倍，3.1～5.0倍。

2.5 β－葡萄糖苷酶酶活性的變化

2.5.1 粗酶液蛋白樣品的濃度測定

根據蛋白定量試劑盒說明書，讀取不同濃度的蛋白標準品BSA 吸光度值，得到各待測粗酶液的蛋白濃度(表3)。

2.5.2 β－葡萄糖苷酶活性檢測

通過DNSA 法檢測到3個組在家蠅不同生長階段均具有降解水楊苷產生葡萄糖的能力，酶活性高低的順序均為1齡幼蟲期＞2齡幼蟲＞3齡幼蟲＞蛹期＞卵期＞成蟲期。β－葡萄糖苷酶活性見圖10。如圖所示，實驗組1和實驗組2 在個體發育的不同階段β－葡萄糖苷酶活力較對照組都有提高趨勢，其中實驗組2 的β－葡萄糖苷酶活力最高，酶活性水平較對照組提高了1.19～2.25倍。實驗組1 的酶活性水平較對照組提高了1.04～1.37倍。

3 結論與討論

表3 粗酶液蛋白濃度(mg/mL)Tab 3 The protein content of crude enzyme solution

圖3 家蠅個體發育不同階段β－葡萄糖苷酶活性Fig.3 BG activity from Musca domestica in different development stage

我國有豐富的秸稈資源，年產量可達7 億多噸，居世界之首(梁榕旺和徐淑莉，2011)。這類物質多處于植物成熟后階段，粗纖維含量很高，在31%至55%之間，受其細胞壁成分木質化的限制，因而秸稈在直接利用上受到了限制(Tawfik and Salem，2012;劉強，2010)。因此利用昆蟲對農業副產品進行資源化處理已經成為當今可持續發展的一個重要思路(張文慶等，2008)。采用農作物副產物秸稈養殖昆蟲，首先是變廢為寶，將垃圾變成動物蛋白飼料，以促進其它經濟動物的生長發育，其次是改善農業環境，把對人和環境的危害，降低到最低甚至為零。如水虻科的黑水虻，擬步甲科的黃粉蟲都已被確定為一種重要的飼用資源昆蟲，在動物蛋白飼料生產、轉化農業廢棄物方面得到應用和推廣(柴志強等，2012;黃詳財，2008)。家蠅為最常見的昆蟲之一，也具有強大的生態轉化的作用，可將生活垃圾、麥麩、谷糠、發酵的農作物秸稈等快速轉化為蛋白質，被國際上列為新型蛋白資源昆蟲之首(Moon et al.，2001;Yadav and Garg，2011;Zhang et al.，2012)。

β－葡萄糖苷酶又稱β－D－葡萄糖苷水解酶，屬于纖維素酶類，其作為纖維素酶系中關鍵的限速酶，是調控昆蟲降解纖維素能力的重要因素。目前對β－葡萄糖苷酶研究多集中在對酶活性和體外的克隆表達的研究(Zhang et al.，2012.;Tokuda et al.，2012;Uchima et al.，2011;Ferreira et al.，2001)，尚未見對昆蟲在不同發育階段、不同生理狀態下β－葡萄糖苷酶基因表達水平和酶活性的變化趨勢報道。因此本實驗借助實時熒光定量PCR 技術，分析不同生長發育階段、不同食物環境下家蠅β－葡萄糖苷酶表達特點和變化趨勢，揭示家蠅在不同生理狀態下對食物中纖維素的利用情況，為降解纖維素的調控因素提供了一些實驗依據。

本研究以不同粗纖維含量的飼料喂養家蠅，結果顯示粗纖維含量的變化對家蠅的生長發育無影響，家蠅身體狀況和品質與常規麥麩飼料喂養無差異(P＞0.05)。在誘導后和正常生長條件下，均有β－葡萄糖苷酶在家蠅體內廣泛存在，其隨著飼料中粗纖維含量增加表達水平也隨之增加。在粗纖維含量為40%，家蠅降解粗纖維效率提高到39.59±0.009 %，家蠅β－葡萄糖苷酶基因表達較對照組提高了1.7～2.4倍;在粗纖維增加到50%，家蠅降解粗纖維效率提高到49.65±0.41%，家蠅β－葡萄糖苷酶表達增加較對照組提高了3.1～5.0倍。采用DNSA 法對家蠅β－葡萄糖苷酶活性的檢測發現，3個組在不同生長發育階段都具有β－葡萄糖苷酶活性，β－葡萄糖苷酶活性大小的順序與家蠅β－葡萄糖苷酶基因mRNA的表達水平是一致的。因此推測家蠅在復雜生存環境條件中，是通過提高自身β－葡萄糖苷酶表達得以補充營養和能量來源，以維持機體的正常生長和發育。這與黃詳財的報道相似(黃詳財，2008)。同時本研究發現β－葡萄糖苷酶活性的變化沒有其mRNA 的變化顯著，推測是由于基因的表達包含轉錄和翻譯兩個層次，它們在發生的時間、位點存在著時空差異，而轉錄后又有轉錄產物的降解、翻譯以及翻譯后加工、修飾等好幾個層面，比基因轉錄更加復雜，因此轉錄水平與蛋白表達水平并不完全一致。

家蠅個體發育不同階段β－葡萄糖苷酶基因表達及其活性檢測結果提示發育過程中β－葡萄糖苷酶基因表達可能與家蠅維持正常生理功能有關。β－葡萄糖苷酶基因在家蠅卵期缺乏轉錄活性，考慮其表達產物是母源性轉錄產物，所檢測到的可能是母體的遺留，故呈低水平表達。幼蟲期是家蠅迅速生長的時期，生長代謝較為旺盛，需要更多的營養物質提供其生長發育，因此β－葡萄糖苷酶作為降解纖維素、提供能量最為重要的效應分子，其表達的水平也呈現上調趨勢，蛹期盡管是相對靜止的蟲態，但為了適應破蛹后復雜環境，仍然延續了幼蟲期β－葡萄糖苷酶活性的增長。β－葡萄糖苷酶在成蟲期達到最大轉錄活性，可能由于家蠅的不斷生長發育，其降解纖維素系統也在逐漸完善，另一方面這個時期也是家蠅活動范圍最大的時期，它們的新陳代謝以及生長發育都受到周圍環境的直接影響，需要盡可能的利用環境中的纖維素以提供必須的營養。這與研究人員報道(黃詳財，2008)，不同齡期的黃粉蟲幼蟲體內的纖維素酶活性隨著齡期的延長逐步提高相一致。由此可見，家蠅β－葡萄糖苷酶活性的高低與其個體發育有著密切的關系。

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