亞洲玉米螟幼蟲血漿蛋白提取方法的比較

王 滔，楊 巽，衣建坤，王 玉，孫 宇，席景會

(吉林大學植物科學學院，長春 130062)

亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis屬于鱗翅目，螟蛾科，蛀食性害蟲，是危害玉米的主要害蟲之一，玉米是我國重要的糧食作物，每年由于亞洲玉米螟的為害造成大量損失，所以防治亞洲玉米螟有著重要的意義。昆蟲具有開放的體液循環系統，其血淋巴負擔著重要的物質和能量的轉運功能，而其中的血漿蛋白正是行使這些功能的主要成員(楊捷頻等，2009)，在昆蟲的防御、抗凍、免疫(Jana et al.，2012)、損傷應答等方面起重要作用(王巖等，2009)，所以血漿蛋白提取方法的比較為研究昆蟲生理生化活動及其分子機制提供了基礎，昆蟲蛋白制備方法較多，但是對于鱗翅目幼蟲的血漿蛋白制備方法基本大多數都是直接裂解法(鐘伯雄等，2003;崔穎俊等，2008)，對于聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的效果并不理想。為了探尋更理想的血淋巴制備方法，本研究比較了3種蛋白質提取方法，為后續進一步的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試蟲:亞洲玉米螟飼養于實驗室培養箱中，采用人工飼養(喬利等，2008)，溫度控制26±0.5℃，光周期16L∶8D，相對濕度75%～85%，收集5 齡幼蟲作為試蟲。

1.2 血淋巴的提取方法

將試蟲冷凍麻醉，剪掉腹足，吸取血淋巴，配合雙管離心法(Xu et al.，2006)，收集血淋巴，-80℃中儲存備用(Britto et al.，2012)。

1.3 蛋白樣品制備

1.3.1 三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法

參照Mechin 等報道的方法(Mechin et al.，2007)，略作修改。取-80℃血淋巴樣品，4℃離心取上清，分裝每管20μL，加 TCA/丙酮，-20℃沉淀，4℃ 離心棄上清，將沉淀用丙酮和80%丙酮各洗1 遍，沉淀真空離心干燥1 min，蛋白粉末-80℃冰箱中儲存備用。

1.3.2 PEG 提取法

取-80℃血淋巴樣品，4℃離心，取上清，分裝為每管20μL，加入80μL 50%的PEG，使終濃度為40%，冰浴1 h，4℃離心，棄上清，將沉淀用丙酮和80% 丙酮各洗一遍，真空離心干燥1 min，蛋白粉末-80℃冰箱中儲存備用。

1.3.3 直接裂解法

參考Nguyen 等的方法(Nguyen et al.，2007)，取-80℃血淋巴樣品，4℃離心，取上清，分裝為每管20μL，加入200μL 4℃預冷的裂解液，4℃離心兩次取上清分裝，樣品凍存于-80℃冰箱中備用。

1.4 蛋白樣品的溶解

取凍存的蛋白質樣品，加入溶解液［5M 尿素，2M 硫脲，2% CHAPS，20 mM DTT，0.002%溴酚藍］中，30℃孵育1.5 h，充分溶解后于13000 rpm離心30 min，取上清進行蛋白濃度測定。

1.5 蛋白含量的測定

參照Bradford 法進行蛋白質濃度的測定(Toyama et al.，2007)。

1.6 SDS-PAGE 電泳

采用不連續垂直板十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析。分離膠濃度12.5%，濃縮膠濃度3%，凝膠厚度為1 mm，銀染方法進行凝膠染色(Yan，2000)，染色后凝膠用Epson Expression 10000XL 掃描儀進行掃描，重復3 次，并利用Quantity One 軟件進行圖像分析。

1.7 雙向電泳

取300μg 蛋白，補加水化液至340μL，膠條為pH4～7 的18 cm 的IPG 膠條，在水化槽中室溫水化16 h，等電聚焦儀中等電聚焦，之后每根膠條在平衡緩沖液Ⅰ和平衡緩沖液Ⅱ中平衡15 min。然后將膠條轉移至12.5%濃度，厚度為1.5 mm 的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上，進行第二向垂直電泳，銀染方法進行凝膠染色(Yan，2000)，染色后凝膠用Epson Expression 10000XL 掃描儀進行掃描，每個方法三次重復，然后利用ImageMasterTM2D Platinum 6.0 軟件進行圖像分析。

2 結果與分析

2.1 不同方法的蛋白提取率

用3種方法獲得的亞洲玉米螟血漿蛋白的提取率有明顯不同，結果見圖1，直接裂解法的提取率最高，為41.91μg/μL，TCA/丙酮沉淀的提取率次之，為14.32μg/μL，PEG 提取法的提取率為8.47μg/μL。利用SPSS13.0 統計軟件，利用One-Way ANOVA 進行分析，采用LSD 法進行多重比較，結果表明:3種蛋白提取方法的蛋白提取率具有極顯著差異(P＜0.01)。

圖1 不同提取方法的蛋白質提取率Fig.1 The rate of protein in extraction from different ethods

2.2 SDS-PAGE 電泳圖譜分析

三種方法提取的血漿蛋白SDS-PAGE 電泳結果見圖2，PEG 提取法得到的蛋白在圖譜上顯示的條帶數最多，為39 條，且從14.4 kDa～116 kDa的范圍內分布均勻，條帶清晰;TCA/丙酮沉淀法得到的蛋白條帶明顯減少，只有23 條，主要集中于35.0 kDa 以上，低分子量的蛋白條帶明顯減少，70 kDa 附近蛋白表達量過大，使蛋白條帶不易分辨;直接裂解法得到的蛋白在圖譜上顯示的條帶數僅為22 條，除高分子量的條帶清楚外，小分子量的條帶可辯率很低。

2.3 雙向電泳圖譜分析

為了進一步檢測亞洲玉米螟血漿蛋白質制備效果，對不同制備方法得到的蛋白樣品進行雙向電泳分析，結果如圖3和圖4，直接裂解法獲得332個蛋白質點，PEG 提取法獲得874個蛋白質點，而TCA/丙酮沉淀法制備的樣品只得到210個蛋白質點。其中PEG 提取法得到的雙向電泳圖譜背景較清晰，蛋白分布最廣，在各個分子量和等電點區域得到的蛋白點都是最多的，分離效果較好。直接提取法的圖譜中的蛋白點明顯少很多，從圖譜中可見，各個區域顯現的蛋白點數具有不同程度減少，相同蛋白的表達豐度也有不同程度的降低。TCA/丙酮沉淀法的圖譜得到的蛋白點數最少，且得到的蛋白點有明顯的彌散情況，相同的蛋白的表達豐度也明顯的降低。另外PEG 提取法得到的電泳圖譜重復性較好，TCA/丙酮沉淀法次之，直接提取法重復性較差。

圖3 不同蛋白提取方法的2-DE 凝膠圖譜Fig.3 2-DE analyses of proteins from different methods

3 結論與討論

TCA/丙酮沉淀法是常用的蛋白質提取方法(Xu et al.，2007)，這種方法能高效的去除蛋白質樣品中的鹽離子，并且能減少蛋白質水解作用和其它蛋白酶的修飾對蛋白分離結果的影響(安少利等，2010)。TCA/丙酮法是對蛋白進行多次沉淀后得到的樣品，制備的蛋白樣品為淡黃色粘稠狀沉淀，加蛋白溶解液溶解后有大量膠狀不溶物，再溶性很差，易造成很多蛋白質的損失，并且對色素，多糖等雜質的去除效果一般(Gorg et al.，2000)。亞洲玉米螟5 齡幼蟲血淋巴有很多色素、多糖和脂類等干擾物質較多，所以用TCA/丙酮沉淀法提取血漿蛋白質得到的SDS-PAGE 蛋白條帶數較少，2-DE 圖譜所檢測到的蛋白點數也是最少的。

直接裂解法提取蛋白的原理是將蛋白質溶解在裂解液中，主要針對可溶性蛋白，其操作布驟簡單，方便快速，有利于蛋白降解，加上成本較低，在微生物的蛋白制備中廣泛應用(Barrios-Llerena et al.，2007)。但是在亞洲玉米螟血漿蛋白的提取中，由于脂類、多糖等雜質的干擾，而此方法對雜質的去除效果差，使蛋白定量不準確，SDS-PAGE 中分離的條帶較少且不清晰，進行雙向電泳時，第一步IEF時電壓不穩定，等電聚焦時間較長，使得蛋白質大量降解，所以圖譜上顯現的蛋白點很少，并且分布的范圍較窄，并且有彌散的現象，所以此方法不適合定量比較研究，特別是進行差異蛋白質組的研究。

利用PEG 提取法制備的蛋白樣品呈乳白色，加入蛋白溶解液溶解后只有少量不溶解，再溶性比較好，進行SDS-PAGE和2-DE 圖譜的效果都比較好，得到的點是最多的也是分布最廣的，分離情況也較好。

因此，利用PEG 提取法進行亞洲玉米螟血漿蛋白樣品的制備，蛋白點數最多，分布最廣泛，分辨率高，重復性好，適于進行后續差異蛋白質組的相關研究。

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