食療對寒熱體質大鼠基因表達作用的研究*

張偉妃，張瑞義，李福鳳，張偉榮

(上海中醫藥大學，上海 201203)

體質是人群及人群中的個體在遺傳的基礎上，在環境的影響下，在其生長、發育和衰老的過程中形成的機能、結構與代謝上相對穩定的特殊狀態[1]。大量研究表明，體質是可變的[2，3]。食療即飲食療養，是利用不同的食物來影響整個機體的功能，使其獲得健康或治愈疾病的一種手段或措施[4]。我們前期的研究表明，寒、熱體大鼠在肝細胞腺苷酸激酶(ADK)活性和細胞能荷、脾淋巴細胞增殖指數(SLPI)、外周淋巴細胞 DNA的復制合成指數(PLDRI)等指標上均有差異[5，6]，且上述指標通過不同性味的食物作用后出現改變[7，8]。同時，我們還率先應用基因芯片技術對寒熱體大鼠的基因表達進行研究，共篩選出寒、熱體質大鼠肝臟中有顯著差異表達的基因31條，其中表達上調的基因26條，表達下調的基因5條，并有特征性基因2條，即Atp6nl(H+-ATP酶)、Ins2(胰島素2)。較有代表性的差異基因為AChE和Txnrd1[9]。本文即在此基礎上用不同性味的食物對上述基因表達的調節作用進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

Wistar雄性大鼠100只，體質量100±10g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供(合格證號SCXK(滬)2008-0016)。實驗條件:動物飼養在上海中醫藥大學實驗動物中心，恒溫20±2℃，自動光-暗控制(LD12∶12 ，即 07∶00-19∶00 光照，19∶00-07∶00暗置)，相對濕度60% ～65%，動物攝食飲水自由。實驗前適應環境飼養1周。通過WMY-01型數字溫度計(精確度為0.01℃)測定法[5]，篩選出常體6只、寒體12只、熱體12只，并將寒體、熱體隨機分為2組進行食療。即將大鼠分為常體組、寒體組、寒體調整組、熱體組、熱體調整組，每組6只。

1.2 食療配方及方法

寒性食療飼料由百合、蓮子、綠豆和基礎飼料按1∶1∶1∶5的比例來制作;熱性食療飼料每 15g飼料里含0.5g五香粉，保證每只大鼠每天攝取五香粉不少于0.5g[8]。常體組、寒體組和熱體組喂飼普通飼料，寒體調整組喂飼熱性飼料，熱體調整組喂飼寒性飼料，時間為90d。

1.3 實驗方法

在實驗過程中觀察食療前后大鼠掌溫變化，于調整結束時分別取上述5組大鼠肝臟右葉肥厚部位，提取組織總 RNA，進行 TaqMan探針法實時熒光定量PCR技術對前期實驗篩選出的特異性基因Atp6n1和差異性基因 AChE和 Txnrd1[9]進行相對濃度檢測。引物及探針均由上海生物工程技術有限公司合成，引物探針序列使用Primer Express 3.0設計。

1.4 統計學方法

數據使用REST 2005相對定量數據分析軟件進行分析。軟件分析后的數據用均數±標準差(s)表示，采用SPSS 13.0版軟件進行齊性檢驗并t檢驗和方差分析，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 食療前和食療后大鼠掌溫變化

表1 食療前和食療后大鼠掌溫變化表(s，℃)

表1 食療前和食療后大鼠掌溫變化表(s，℃)

注:與常體組比較:＊＊P＜0.01;與寒體組比較:※P＜0.05，※※P＜0.01;與寒體調整組比較:▲▲P＜0.01;與熱體組比較:●●P＜0.01

組個月常 體 組 6 27.24±0.29 27.14±0.45 26.17±0.56 26.64±0.別 例數 食療前 食療半個月 食療1個月 食療2個月 食療3 26.12±0.61 27.07±0.59 27.49±0.41 77 27.77±0.55寒 體 組 6 26.56±0.26＊＊ 26.83±0.33 25.76±0.38 26.65±0.50 27.45±0.51寒 體 調 整 組 6 26.62±0.12＊＊ 27.14±0.41 26.12±0.29 27.28±0.74 27.97±0.81熱 體 組 6 27.63±0.20＊＊※※▲▲ 27.34±0.54※ 26.38±0.31※ 27.34±1.63 27.92±1.15熱 體 調 整 組 6 27.77±0.21＊＊※※▲▲ 26.48±0.18＊＊▲▲●●

寒熱性味食物對大鼠掌溫有影響。食療半個月后，寒體調整組掌溫升高，且與常體組差異無統計學意義，熱體調整組與熱體組比較差異有統計學意義意義(P＜0.01)。食療1個月后，寒體調整組與熱體調整組均與常體組差異無統計學意義(P＞0.05)。食療2個月、3個月時，各組差異已均無統計學意義(P＞0.05)。在不同階段觀察常體組、寒體組和熱體組均有波動，但波動方向均一致，可能是由于在大鼠生長的不同階段測量且受外界環境影響所致。

2.2 食療后 Atp6n1、AChE和 Txnrd1基因表達量的比較分析

表2 食療后Atp6n1、AChE和 Txnrd1基因表達量比較分析表(x ± s，℃)

通過實時熒光定量PCR驗證得出，食療3個月后，寒體調整組 Atp6n1、AChE表達量降低不明顯，仍與常體組差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，Txnrd1有上升趨勢，且與常體組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。熱體調整組Atp6n1上升明顯，與各組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)，AChE、Txnrd1均有上調趨勢，與熱體組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。與常體組和熱體組比較，寒體組Atp6n1、AChE表達仍上調，Txnrd1下調，與前期實驗結果一致[10]，且實驗指標的變化趨勢與大鼠掌溫變化基本相一致，說明不同性味的食物確實能引起寒熱體大鼠基因表達水平上的變化。

3 討論

大鼠自然群體中存在寒熱體質差異，并可通過測定大鼠后腳掌掌溫來篩選出寒體、熱體及常體體質大鼠。與人為造模方法相比，自然體質篩選法有不破壞動物自身機能狀態的優越性，符合中醫的整體觀。體質的穩定是相對的，具有一定的可調性，根據體質的特點以及食療學的理論，恰當地選擇相應的食物以調整病理性體質和防治疾病是臨床實踐的迫切需要[11]。本實驗取大辛大熱之五香粉，寒涼之品百合、蓮子、綠豆對前期實驗篩選出的寒熱體質大鼠進行調整并對特征性基因Atp6nl(H+-ATP酶)和較有代表性的差異基因AChE及Txnrd1進行研究。H +-ATP 酶 (ATPase， H + transporting，lysosomal V0 subunit a isoform 1，Atp6nl)是 ATP 酶的1種，主要作用是水解ATP，產生的能量用于將細胞漿中的 H+泵入溶酶體中[12]。乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)又稱真性膽堿酯酶，是生物神經傳導中的一種關鍵性的酶，主要存在于膽堿能神經末梢突觸間隙，該酶能降解乙酰膽堿，終止神經遞質對突觸后膜的興奮作用，保證神經信號在生物體內的正常傳遞[13]。硫氧還蛋白還原酶 1(thioredoxin reductase 1，Txnrd1)是硫氧還蛋白還原酶的一種，Txnrd1和其底物硫氧還蛋白1(Trx1)組成了一個氧化還原系統，Txnrd1促進了 Trxl的還原，調節氧化應激。低表達的Txnrd1，導致氧化還原反應減少，使各種氧化物堆積，降低了能量利用率。本次實驗結果發現，食療3個月后，寒體調整組Txnrd1表達上調，與常體組比較已無統計學意義;Atp6nl、AChE在熱體調整組中表達顯著上升，可能寒涼之品的食療方對熱體大鼠的體質影響明顯，體質已有所調整，引起基因表達水平的變化。食療調整后，寒體調整組和熱體調整組在基因表達水平上均有所變化，但寒體調整組變化不及熱體調整組變化明顯，可能是由于樣本量不足(每組6只)，或是食療調節時間不足引起，亦有可能寒體體質本身不敏感，調節時間需要比熱體組調整時間長。熱體調整組Txnrd1表達反而上升明顯，幾乎是熱體組的2倍，且已超過常體的表達量，其機制有待進一步探討。

本實驗結果表明，不同性味的食物對寒體和熱體大鼠在基因表達水平上均有顯著的調整作用，為臨床上通過食物調節特異性基因表達水平來改善體質提供了實驗依據，也為中醫的食療學說提供了分子生物學的實驗依據。

[1]匡調元.調元·體質·食養[M].上海:上海科學技術文獻出版社，1994.

[2]匡調元.體質食療學研究[J].中醫雜志，1997，38(10):626-627.

[3]母國成.中醫體質學說及其異化[J].新中醫，1983，15(9):9-10.

[4]錢伯文，孟仲法，陸海明，等.中醫食療學[M].上海:上海科學技術出版社，1987:4.

[5]張偉榮，薛惠娟，趙偉康，等.寒體和熱體的實驗研究(Ⅰ)[J].中西醫結合雜志，1991，11(8):477-479.

[6]丁鏞發，錢汝紅，匡調元，等.寒體和熱體的實驗研究(Ⅱ)[J].中西醫結合雜志，1991，11(9):550-552.

[7]張偉榮，薛惠娟，匡調元，等.食物調整病理性體質的生化研究[J].中國中醫基礎醫學雜志，1996，2(1):35-36.

[8]丁鏞發，錢汝紅，匡調元，等.體質的實驗研究(V)—飲食對常體、熱體、寒體大鼠淋巴細胞體外增殖能力的影響[J].上海中醫藥大學學報，1994，1(8):53-55.

[9]魏蓓蓓，張偉妃，張瑞義，等.中醫寒體與熱體特征性基因篩選的研究[J].中國中醫基礎醫學雜志，2010，16(7):607-608.

[10]魏蓓蓓，張偉妃，張瑞義，等.中醫寒體與熱體基因差異表達的 RT-PCR 分析[J].上海中醫藥大學學報，2011，3:68-70.

[11]張偉妃，張偉榮，魏蓓蓓.食療調節體質的研究概況[J].中華中醫藥雜志，2010，25(5):734-737.

[12]Weert AW，Durn KW，Gueze HJ，et al.Transport form late endosomes to lysosomes，but not sorting of integral membrane proteins in endosomes，depends on the vacuolar proton pump[J].J Cell Boil，1995，130(4):821.

[13]徐恩斌，張忠兵，謝渭芬.乙酰膽堿酯酶的研究進展[J].國外醫學·生理、病理科學與臨床分冊，2003，23(1):73-75.