補肝益腎法對更年期模型大鼠行為變化的調節(jié)作用*

劉 瑩，趙宏艷，于 崢，時彥菊，劉 紅，潘靜華，于志靜，鞠大宏，喻長遠△

(1.上海市松江區(qū)方塔中醫(yī)醫(yī)院婦科，上海 201600;2.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700;3.北京化工大學，北京 100700)

“肝腎同源”是中醫(yī)臟腑相關理論的重要內容之一，在臨床上有著廣泛的應用，對該理論的闡明將有助于更好地指導臨床實踐。本文從方藥角度對“肝腎同源”理論開展研究，欲對“肝腎同源”理論有進一步的認識。

1 材料

1.1 實驗動物

選用健康雌性 SPF級 SD大鼠96只，體質量200～220 g，由中國藥品生物制品檢定所提供(許可證編號SCXK(京)2009-0017)，在中日友好醫(yī)院臨床研究所動物室屏障系統(tǒng)(實驗動物室許可證號SYXK(京)2005-0019)。

1.2 藥物

實驗所用中藥材(山茱萸、丹皮、熟地、澤瀉)購自北京同仁堂藥店。補肝藥物水煎液(山茱萸30 g，丹皮10 g)、益腎藥物水煎液(熟地30 g，澤瀉10 g)、補肝益腎藥物水煎液(山茱萸15 g，丹皮5 g，熟地15 g，澤瀉5 g)，常規(guī)水煎制濃縮，生藥含量均為0.3688g/ml。此藥物濃度是按人日用臨床劑量，經人-大鼠體表面積比值折算成相當于人臨床劑量而成。

2 方法

2.1 模型制作及分組

大鼠適應喂養(yǎng)1周后，隨機選取16只作為正常對照組和假手術組，其余大鼠麻醉后，行雙側卵巢切除手術制作更年期模型大鼠[1]。手術組大鼠的手術過程同造模組，但不切除卵巢，只切除卵巢周圍的脂肪組織。術后7 d作陰道涂片，觀察造模后動物動情周期，每天1次，連續(xù)5 d，挑選不顯周期性改變的大鼠為更年期動物模型。將造模成功的75只大鼠隨機分為模型組、己烯雌酚組、補肝藥物組、益腎藥物組、補肝益腎藥物組5組，每組15只。

2.2 給藥

造模型成功后，對各給藥組大鼠灌胃給藥:補肝藥物組大鼠灌服補肝藥物水煎液3.688 g生藥/kg體質量;益腎藥物組大鼠灌服益腎藥物水煎液3.688 g生藥/kg體質量;肝腎同補藥物組大鼠灌服肝腎同補藥物水煎液3.688 g生藥/kg體質量;己烯雌酚組大鼠灌服己烯雌酚水溶液0.046 mg/kg體質量。以上給藥每天1次，連續(xù)4周。空白對照組、假手術組、模型組大鼠按上法灌服等體積純凈水。

2.3 取材

給藥4周后將大鼠斷頭處死，立即取出子宮和陰道并稱重，每只大鼠的子宮和陰道重量(g)分別與對應大鼠體質量(g)的比值為子宮和陰道系數。

2.4 指標的測定

2.4.1 大鼠一般狀態(tài)觀察 每天仔細觀察大鼠的精神狀態(tài)、皮毛色澤、活動度及糞便等全身情況。實驗開始后每7d用電子秤稱量大鼠體質量，并根據體質量調整給藥量。

2.4.2 大鼠行為方法的測定 采用曠場實驗法測定，具體方法如下:實驗用黑色有機玻璃自制曠場箱，該箱為立方形，長 ×寬 ×高為105 cm×105 cm×50 cm，內側壁及底面為黑色。曠場箱正上方安置攝像頭，在安靜無干擾并杜絕參照物的環(huán)境條件下進行。操作者握住大鼠尾根部1/3處，輕輕將大鼠放入曠場箱的正中，開始同步錄像、計時。觀察5 min內大鼠活動情況。取出大鼠后，用毛巾蘸清水及低濃度酒精徹底擦拭箱底，并等待其揮發(fā)擴散，避免留有氣味而干擾下只大鼠的觀察結果。觀察如下指標來量化大鼠的情緒狀態(tài):大鼠總路程、平均速度、靜止時間、進入中心區(qū)次數。曠場實驗的分析方法:運用動物行為活動標記分析系統(tǒng)Xeye Aba V3.1軟件，對各組大鼠的行為進行分析評價。

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 補肝益腎藥對各組大鼠體質量的影響

給藥前，去勢大鼠體質量與假手術組比較有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。

給藥7d后，與假手術組比較，模型組、補肝藥物組、益腎藥物組和補肝益腎藥物組大鼠體質量明顯上升(P＜0.05，P＜0.01)，而己烯雌酚組大鼠體質量明顯下降(P＜0.05);與模型組比較，己烯雌酚組大鼠體質量明顯下降(P＜0.01)。

從給藥后14d起至給藥結束，與假手術組比較，模型組、補肝藥物組、益腎藥物組和補肝益腎藥物組大鼠體質量明顯上升(P＜0.01)，己烯雌酚組大鼠體質量明顯下降(P＜0.01);與模型組比較，己烯雌酚組大鼠體質量明顯下降(P＜0.01)，補肝藥物組、益腎藥物組和補肝益腎藥物組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義;補肝藥物組、益腎藥物組和補肝益腎藥物組大鼠體質量明顯高于己烯雌酚組(P＜0.01)。補肝藥物組、益腎藥物組和補肝益腎藥物組之間大鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義。

表1 各組大鼠體質量變化(g)

3.2 補肝益腎藥對各組大鼠子宮和陰道重量/系數的影響

與假手術組比較，模型組、己烯雌酚組、補肝藥物組、益腎藥物組和補肝益腎藥物組大鼠子宮和陰道重量明顯下降(P＜0.01)，其系數亦明顯下降(P＜0.01，P ＜0.05)。

與模型組比較，己烯雌酚組大鼠子宮和陰道重量差異無統(tǒng)計學意義，但其系數顯著升高(P＜0.01);補肝益腎藥物組大鼠子宮和陰道重量與其系數明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，補肝藥物組、益腎藥物組和與模型組比較，子宮和陰道重量與其系數有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。

補肝藥物組、益腎藥物組、補肝益腎藥物組與己烯雌酚組比較，子宮和陰道重量明顯升高(P＜0.01)，但系數卻較低(P＜0.01)。

3.3 補肝益腎藥對各組大鼠焦慮行為(曠場實驗)的影響

與假手術組比較，模型組和己烯雌酚組大鼠總路程、平均速度明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，靜止時間明顯下降(P＜0.01);補肝藥物組、益腎藥物組及補肝益腎藥物組大鼠與假手術組比較差異無統(tǒng)計學意義。

與模型組比較，己烯雌酚組大鼠總路程、平均速度及靜止時間差異無統(tǒng)計學意義;補肝藥物組大鼠平均速度明顯下降(P＜0.05)，靜止時間明顯上升(P＜0.01);益腎藥物組大鼠平均速度明顯下降(P＜0.01)，靜止時間明顯上升(P＜0.01);補肝益腎藥物組大鼠總路程、平均速度明顯下降(P＜0.01，P＜0.05)，靜止時間明顯上升(P＜0.01)。

與己烯雌酚組大鼠相比，補肝藥物組大鼠靜止時間明顯上升(P＜0.01);益腎藥物組大鼠平均速度明顯下降(P＜0.05)，靜止時間明顯上升(P＜0.01);補肝益腎藥物組大鼠總路程、平均速度明顯下降(P＜0.05)，靜止時間明顯上升(P＜0.01)。各組大鼠進入中心區(qū)次數差異均無統(tǒng)計學意義。

表2 各組大鼠子宮和陰道重量及其系數的變化

表3 各組大鼠總路程、平均速度、靜止時間及進入中心區(qū)次數的變化

4 討論

更年期綜合征是指更年期婦女因卵巢功能衰退，引起機體內分泌失調、免疫力低下和植物神經功能紊亂為主要特征的一組證候群。中醫(yī)理論認為，更年期綜合征雖與五臟功能失常、陰陽氣血失衡有關，但因婦女年屆絕經前后，大多已經歷了經、孕、產、乳幾個階段，且婦女絕經前后腎氣漸衰，天癸將竭，極易耗血傷精，損傷肝腎，所以本病當主要源于肝腎二臟的精血虛少，而出現功能衰退和失調。因此，在治療上臨床常采用補肝益腎法治療更年期綜合征。補肝益腎法實為中醫(yī)“肝腎同源”的體現，“肝腎同源”主要是闡述肝與腎二臟關系之密切。本文以六味地黃丸為基礎方，觀察方中補肝藥物、益腎藥物及補肝、益腎藥物聯用對更年期模型大鼠的治療作用，以期從方藥角度為闡明“肝腎同源”內涵提供進一步的實驗依據。

目前其國內外更年期綜合征主要有自然衰老、卵巢摘除、X光照射破壞卵巢3種動物模型。因去勢動物模型造模時間短，模型成功率高，所以本實驗選用去勢法制作更年期綜合征動物模型。本實驗結果顯示，去卵巢法制作的更年期模型大鼠，體質量明顯增加，子宮及陰道重量與系數明顯下降，補肝益腎藥物治療后可明顯增加子宮及陰道重量與系數，補肝藥物、益腎藥物雖有增加趨勢，但無統(tǒng)計學意義。

曠場實驗是目前最常用的一種動物心理實驗方法。通過記錄大鼠進入一個新異環(huán)境后，在一定時間內的探究行為和自發(fā)活動的情況，以反映大鼠在新環(huán)境中的探究行為和適應能力[4]。本實驗利用攝像監(jiān)控手段，對大鼠的活動進行監(jiān)測，因而能對大鼠的焦慮、抑郁程度進行客觀分析。本課題選用曠場實驗中有代表性的觀察指標，主要有大鼠總路程、平均速度、靜止時間、進入中心區(qū)次數，并對其情緒狀態(tài)進行分析。實驗結果顯示，模型組大鼠與假手術組比較，總路程、平均速度明顯升高，靜止時間明顯下降，說明模型組大鼠焦慮、抑郁程度高，這與臨床更年期的癥狀有相似之處。與模型組比較，補肝藥物組大鼠平均速度明顯下降，靜止時間明顯上升，表明補肝藥物對大鼠的焦慮情緒有較好的調節(jié)作用;益腎藥物組大鼠靜止時間明顯上升，總路程、平均速度有下降趨勢，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，說明益腎藥物對更年期大鼠有部分調節(jié)作用;補肝益腎藥物組大鼠總路程、平均速度明顯下降，靜止時間明顯上升，反映補肝益腎藥物對大鼠的焦慮情緒有很好的調節(jié)作用;而己烯雌酚組大鼠總路程、平均速度及靜止時間與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，這一結果部分反映益腎藥物、補肝藥物和補肝益腎藥物對更年期大鼠精神方面的調節(jié)作用要優(yōu)于己烯雌酚。補肝藥物與益腎藥物聯合使用對更年期模型大鼠的子宮及陰道重量與系數、行為學變化改善作用要好于單獨使用補肝藥與益腎藥物，從方藥的角度部分詮釋了“肝腎同源”的內涵。

[1]鞠大宏，于福祿，張麗坤，等.滋陰補腎法對卵巢切除所致骨質疏松大鼠成骨細胞COX-2蛋白和mRNA表達的影響[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2006，14:44-46.

[2]Eilam D.Open-field behavior withstands drastic changes in arena size[J].Behav Brain Res，2003，14(2):53-62.