寧神溫膽湯對大鼠海馬凋亡蛋白bax、bcl-2表達的影響*

胡久略，謝 輝，龍志江，孟 瓊，張彥輝，賀又舜

(湖南中醫藥大學，長沙 410007)

神經病理學提示精神分裂癥存在著神經元凋亡，這可能是其發病的重要機理之一[1]。“痰”作為一種病邪，內可影響到臟腑，外可影響到筋骨，上逆則精神錯亂[2]。溫膽湯臨床用治無形之痰所致的精神疾患，課題組前期研究發現對多巴胺神經遞質有效[3]。本實驗在溫膽湯原方基礎上增加了酸棗仁、石菖蒲，以增強安神作用，并主要探討了寧神溫膽湯對精神分裂癥模型鼠海馬神經細胞促凋亡蛋白bax、抑凋亡蛋白bcl-2表達的影響，以揭示該藥抗精神分裂癥的部分作用機理，為臨床推廣提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 SD雌性大鼠 40只，SPF級[5]，體質量200±20g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供(實驗動物許可證 SCXK(湘)2009-0001)。飼養條件:每籠5只，室溫25±2℃，相對濕度65±5%，標準飼料，全營養喂養，自由飲水，籠具每周清洗消毒1次，紫燈滅菌10 min。實驗動物在實驗室飼養房內觀察5d，無異常者用于本試驗。鼠用全價顆粒飼料由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供(實驗動物專用飼料生產許可證SCXK(湘)2009-0009)。

1.1.2 藥物 酸棗仁、石菖蒲、半夏、竹茹、枳實、陳皮、茯苓、甘草購自湖南中醫藥大學附一院藥劑科，由湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室鑒定。酸棗仁為小喬木植物酸棗 Ziziphus jiujiuba Miill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou.的成熟種子，石菖蒲為南星科植物石菖蒲 Acorus tatarinowii Schott.的干燥根莖，半夏為南星科草本植物半夏 Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的塊莖，竹茹為禾本科植物淡竹 Phyllostachysmigra var.henonis.Stapf的莖的中間層，枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L的幼果，陳皮為蕓香科植物橘 Citrus reticulata Blanco的成熟果皮，茯苓為多孔科真菌茯苓 Poria cocos(Schw.)Wolf的菌核，甘草為豆科草本植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch的根莖。

1.1.3 試劑 (R)-(-)阿樸嗎啡鹽酸半水(日本和光純藥工業株式會社，批號20110408)、鹽酸氯丙嗪注射液(上海和豐制藥有限公司，批號091201)、生理鹽水(四川科倫藥業股份有限公司，批號B11050207)、bax、bcl-2試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號BA0315、BA0412)。

1.1.4 儀器 PG802-S型電子天平(梅特勒-托力公司，德國)，MAIS醫學圖像分析系統(北航公司，中國)，CM-1800恒溫冰凍切片機(山頓公司，英國)，MoticB5雙目生物顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司，中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 中藥湯劑制備 寧神溫膽湯組成:酸棗仁 10g，石菖蒲 10g，半夏 10g，竹茹 10g，枳實 10g，陳皮10g，茯苓30g，甘草6g。全方各藥物先加水浸泡30min，煎時加藥材量8倍的水，沸騰后煎40min過濾取汁;二煎加藥材量6倍的水，沸騰后煎30min過濾，兩煎所得濾液混合后濃縮成藥物與水的比例為1∶1，4℃ 冰箱保存。

1.2.2 動物模型建立 動物適應飼養環境5d后進行試驗，隨機分為正常組、模型組、寧神溫膽湯組、氯丙嗪組4組，每組10只。最后1d給藥1h后，正常組左側腹腔注射2mg·kg－1生理鹽水，其他3組大鼠左側腹腔按2mg·kg－1(注射量為0.1mL/20g)的標準注射阿樸嗎啡鹽酸半水，誘發SD大鼠精神分裂癥模型，觀察15min后斷頭處死。

1.2.3 給藥方法 寧神溫膽湯組于造模前連續灌胃給藥，每次給藥 20mL·kg－1(相當于灌胃20mg·kg－1);氯丙嗪組先連續灌胃等容量生理鹽水14d，每天1次，最后7d腹腔注射鹽酸氯丙嗪4.5mg·kg－1(按體表面積計算，相當于正常人用量);正常組和模型組用等容量生理鹽水灌胃，每天灌胃1次，共21d。

1.2.4 大鼠海馬神經細胞bax、bcl-2蛋白指標測定 誘發SD大鼠精神分裂癥模型觀察15min后，對大鼠麻醉下行左心室主動脈插管后，給予4%多聚甲醛(4℃)灌注固定，迅速斷頭取腦后固定。用恒冷冰凍切片機行冠狀面連續切片，從視交叉處開始切片，片厚10～12μm，每個標本切片10到12張。0.3%H2O2室溫下孵育10min;滴加5%BSA血清封閉液37℃20min:滴加一抗4℃ 過夜;加生物素化二抗37℃ 30min;加SABC37℃ 20min;DAB顯色，剃度酒精脫水;二甲苯透明;中性樹膠封片。每組次染色切片數均衡以避免DAB顯色時間不等對組間造成的影響。一抗稀釋濃度為1∶200。采用 MAIS醫學圖像分析系統進行圖像分析。每張切片隨機測定5個視野，在400倍視野下測光密度值，取其均值作為該鼠的平均光密度值。

1.2.5 數據統計分析 統計分析采用SPSS 16.0統計軟件，所有數據用均數±標準差(s)表示。所有統計檢驗均采用雙側檢驗，符合正態性和方差齊性的資料采用LSD檢驗，不符合正態性和方差齊性的資料采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 行為觀察

分組喂養并觀察各組大鼠體態、發育，每周稱量體質量。氯丙嗪組在注射氯丙嗪后明顯發現，本組大鼠精神萎靡、毛發稀疏、爬行緩慢、陰囊明顯松弛，其他各組無此類表現。實驗最后1d注射阿樸嗎啡鹽酸半水的3組大鼠同時出現不同程度的啃、咬、點頭、亂爬等精神分裂癥癥狀，以模型組最為明顯。

2.2 病理檢測結果

免疫組化法處理 bax、bcl-2后陽性細胞呈棕黃色。圖2顯示，正常組海馬有3～4層錐體細胞，排列整齊緊密，神經細胞核大而圓，透明，胞質豐富，核仁清楚，胞漿無棕色顆粒表達;模型組大鼠海馬區神經元bax陽性表達明顯增多，bcl-2陽性表達明顯減少;寧神溫膽湯組、氯丙嗪組海馬區bax陽性表達明顯減少，bcl-2陽性表達均明顯增多。

圖1 各組小鼠海馬區bax的表達(×400)

圖2 各組小鼠海馬區bcl-2的表達(×400)

2.3 寧神溫膽湯對大鼠海馬區bcl-2、bax蛋白表達的影響

采用免疫組織化學方法檢測 bax、bcl-2蛋白表達，在400倍光鏡下隨機選取5個視野進行定量分析，測量棕黃色反應物的平均光密度，分析蛋白的表達情況。經統計學處理表明，與模型組比較，寧神溫膽湯組、氯丙嗪組bax蛋白表達顯著降低，bcl-2蛋白表達升高，bcl-2/bax比值升高，差異具有統計學意義(P＜0.01～0.05);寧神溫膽湯組、氯丙嗪組組間比較，寧神溫膽湯 bax高于氯丙嗪組，bcl-2及bcl-2/bax比值低于氯丙嗪組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，說明寧神溫膽湯能抑制海馬區神經細胞的凋亡。

表1 寧神溫膽湯對大鼠海馬區bax、bcl-2蛋白表達的影響(n=10，s)

表1 寧神溫膽湯對大鼠海馬區bax、bcl-2蛋白表達的影響(n=10，s)

注:與模型組比較:▲ P＜0.01，★P≤0.05;氯丙嗪與溫膽湯組間比較:■P＜0.05。

組bcl-2/bax正 常 組 0.2820±0.0426▲ 0.5480±0.0349▲ 1.9881±0.3503別 bax平均光密度 bcl-2平均光密度▲★■模 型 組 0.7750±0.0350 0.1550±0.0303 0.2006±0.0403寧神 溫 膽 湯 組 0.4980±0.0391★ 0.2270±0.0464★ 0.4575±0.0955★鹽酸 氯 丙 嗪 組 0.3980±0.4517★■ 0.4490±0.0340★■ 1.1372±0.1116

3 討論

Bcl-2家族是膜的整合蛋白，根據功能和結構可分為兩類，一類是抑制凋亡(anti-apoptotic)，如 Bcl-2、Bc1-xl、Bcl-w、Mcl-1; 一 類 是 促 進 凋 亡(proapoptotic)，如 Bax、Bak、Bad、Bid、Bim。Bcl-2 抗凋亡的機制目前認為主要有:(1)拮抗促凋亡蛋白bax;(2)抑制促凋亡蛋白細胞色素C自線粒體釋放到胞質;(3)阻止胞質中的細胞色素C激活caspase。Bax是極重要的促細胞凋亡分子，表達十分廣泛。主要定位于細胞質，受到凋亡因子誘導，向線粒體轉位，并寡聚化在線粒體外膜形成跨膜通道，或者開啟線粒體的PTP孔(線粒體通透性轉換孔)，釋放細胞色素C。大量研究發現，Bcl-2/Bax兩蛋白之間的比例關系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵，因此Bcl-2/Bax構成一個凋亡過程變阻器。

本實驗檢測精神分裂癥模型大鼠海馬神經組織時發現，Bcl-2蛋白的表達明顯下降，而 Bax蛋白的表達明顯升高，導致Bcl-2/Bax的比例下降，說明精神分裂癥可導致Bcl-2/Bax的比例下降，從而促進海馬神經細胞凋亡，此結果與其他一些研究結果類似[6]。而寧神溫膽湯干預治療精神分裂癥大鼠后出現Bcl-2蛋白的表達升高，Bax蛋白的表達下降，從而導致Bcl-2/Bax的比例升高，這說明寧神溫膽湯抑制海馬神經細胞凋亡信號通路作用機理是雙向的，一方面可促進抗凋亡因子Bcl-2的分泌，另一方面可抑制促凋亡因子Bax的分泌，從而保證海馬神經細胞發揮正常的生理功能，達到治療精神分裂癥的作用。

實驗結果表明，寧神溫膽湯對抑制精神分裂癥大鼠海馬區神經元有顯著療效。眾所周知，臨床治療精神分裂癥的西藥分典型與非典型藥物，包括氯丙嗪、氟哌啶醇、舒必利、氯氮平、奧氮平、利培酮等，它們在治療過程中易出現錐體外系不良反應和鎮靜、體位性低血壓與植物神經紊亂等不良反應，且對慢性遷延病程者療效不佳，常發生體質量增加、高血糖、高血脂，以及持續的高催乳素血癥導致的性功能異常和月經紊亂，少數發生肝功能、血象異常與心電圖改變等副作用。我們在實驗研究過程中，明顯發現使用氯丙嗪后大鼠精神萎靡、毛發稀疏、發育減緩，因此探索溫膽湯這類療效好、副作用小的抗精神分裂癥的中藥復方甚為迫切。

[1]李國榮，朱娩兒.精神分裂癥和神經元凋亡[J].中國神經疾病雜志，2007，33(10):634.

[2]邵建軍.溫膽湯加減在精神心理科應用132例[J].光明中醫，2011，26(5):964.

[3]謝輝，賀又舜.溫膽湯及其化學組份對大鼠紋狀體DA合成作用影響的研究[J].中醫雜志，2004，20(3):66

[4]賀又舜，傅俊英，袁振儀，等.溫膽湯對小鼠中樞神經遞質影響的實驗研究[J].中國中醫藥雜志，1999，6(4):25

[5]徐淑云.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛生出版社，2001:856.

[6]慕寶龍，田茸，舍雅莉，等.平癇顆粒對癲癇大鼠海馬神經元細胞凋亡及基因表達的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2012，19(6):35.