當歸補血湯加味對GK大鼠血-視網膜屏障保護作用的實驗研究

郭藝娟，高德宏，劉素嬛，李學軍，楊叔禹

(廈門大學附屬第一醫院，廈門 361003)

糖尿病視網膜病變(DR)的實質是微血管病變，早期病理改變主要包括選擇性毛細血管周細胞喪失、毛細血管基底膜增厚、內皮細胞增生、微血管瘤的形成等。而視網膜細胞喪失導致的血-視網膜屏障破壞及血管通透性的增高是糖尿病視網膜微血管病變最早期的特征之一，血-視網膜屏障損傷使得液體或血液從血管滲透到視網膜，引起視網膜腫脹[1]，從而導致 DR 的發生。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

伊凡思藍(Sigma公司生產)，檸檬酸(上海阿拉丁試劑有限公司生產)，多聚甲醛(上海試劑總廠經貿公司生產)，甲酰胺(上海阿拉丁試劑有限公司生產)，戊巴比妥鈉(上海索萊寶生物科技有限公司生產)。

血糖儀(美國強生公司生產)，超聲波細胞粉碎機(美國Sonics公司生產)，手術顯微鏡(深圳市叁諾西努科技有限公司生產)，超高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司生產)，超微量分光光度計(Thermo Scientific公司生產)。

1.2 實驗動物

24周齡 SPF級雄性 GK大鼠，體質量 280g～350g，購自上海斯萊克實驗有限公司(許可證號:SCXK(滬)2007-0005)。將其隨機分為模型組、導升明組、中藥低劑量組、中藥高劑量組4組，每組各15只。清潔級雄性Wistar大鼠設為正常對照組，購自北京維通利華實驗技術有限公司(許可證號SCXK(京)2006-0009)。分籠飼養，飼養條件保持在室溫18℃ ～25℃，空氣流通，相對濕度為體積分數55%～70%，12h光照維持，晝夜循環。動物在籠中自由攝食飲水。飼料為大鼠全價顆粒飼料，由廈門大學實驗動物中心提供。每日相對固定時間灌胃1次，連續灌胃3個月。

1.3 給藥方法

正常對照組:正常飲食，不灌胃;模型組:用與中藥組等體積的蒸餾水灌胃;導升明對照組:用相當于臨床用藥量10倍的導升明混懸液灌胃;中藥低劑量組:用相當于臨床用藥量5倍的中藥灌胃;中藥高劑量組:用相當于臨床用藥量20倍的中藥灌胃。

1.4 血-視網膜屏障損害的檢測

暴露大鼠尾靜脈，EB 45mg/kg在1min內由靜脈緩慢注入。循環120min后，1%戊巴比妥納麻醉后，將預熱至37℃，以 pH 3.5、0.05mol/L的檸檬酸緩沖液稀釋的1%多聚甲醛緩沖液，由左心室灌注，同時剪開右心耳，灌注壓力 120mmHg，灌注時間2min。灌注結束后，立即取出眼球，分離視網膜，45℃ 真空晾干5h，稱重。將視網膜與300μL甲酰胺在70℃下孵育18h，然后將提取液移入超濾離心管，離心機在4℃、40000r/min下超高速離心20min。取上清液1ul用超微量分光光度計測其吸光度(A)值，測定623nm(參考波長740nm)波長下樣品的吸光度值之差(凈吸光度值)，凈 A值 =A623－A740，建立EB染料濃度在甲酰胺中的標準曲線。每一樣品測量6次，最后取其平均值。用視網膜干重(mg)標準化EB(ng)含量，結果表示為:ng/mg。

1.5 統計方法

應用SPSS 13.0統計軟件分析，計量資料采用均數±標準差(s)表示，2組比較，行兩樣本均數比較的t檢驗;多組比較行單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組大鼠的血糖、血脂情況

表1顯示，通過對治療后GK大鼠的血糖進行檢測，模型組及各治療組血糖高于正常對照組(P＜0.05);對模型組及各治療組血糖比較差異無統計學意義(P＞0.05);通過對GK大鼠的血脂進行檢測，模型組及各治療組總膽固醇處在較高水平，與正常對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，對模型組及各治療組甘油三酯比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。

表1 各組大鼠的血糖、血脂情況(s，mmol/L)

表1 各組大鼠的血糖、血脂情況(s，mmol/L)

注:與正常對照組比較:*P＜0.05

組別 血糖(mmol/L)總膽固醇(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)正常對照組0.982±0.353 6.272±0.856 1.486±0.143 0.953±0.242模 型 組19.718±3.897*2.527±0.214*1.003±0.445導 升 明 組21.798±2.976*2.693±0.260*0.910±0.454中藥低劑量組 20.930±6.851*2.420±0.228*0.772±0.335中藥高劑量組 18.510±7.319*2.422±0.108*

2.2 各組大鼠視網膜組織的EB滲透量

使用分光光度計進行標準溶液的全程光譜掃描，找到伊凡思藍在甲酰胺中的最大吸收波長為623nm，選取參考波長為 740nm，以623nm～740nm波長對配好的已知濃度的標準溶液進行掃描，可以測定出標準溶液的吸收光度值，用得到的吸收光度值和濃度作直線擬合，得到直線回歸方程:y=13.692x－0.0026，x表示凈吸光度值，y表示伊凡思藍在甲酰胺中的濃度。

表2顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠視網膜組織中EB的滲透量明顯增加了3.8倍，差異有統計學意義(P＜0.05)。經導升明及中藥治療后，視網膜組織中EB的滲透量下降，導升明組、中藥低劑量組、中藥高劑量組分別降低了43.5%、37.4%、51.7%。其中，導升明組、中藥低劑量組中EB的滲透量有下降趨勢，但與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05);中藥高劑量組EB的滲透量與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，與正常對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠視網膜組織的EB滲透量(s，ng/mg)

表2 各組大鼠視網膜組織的EB滲透量(s，ng/mg)

注:與正常對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05

組別眼數s(ng/mg)3.166±1.375模 型 組 10 12.147±4.546＊＊導 升 明 組 5 6.866±1.014*中藥低劑量組 10 7.600±1.937＊＊中藥高劑量組 6 5.866±2.397正常對照組6△

3 討論

本實驗所采用的GK大鼠為自發性2型糖尿病動物模型，是對正常Wistar種系大鼠進行口服葡萄糖耐量試驗并篩選出高血糖的個體培育出的一種原發性非肥胖性的2型糖尿病模型，主要表現為非肥胖性、胰島素抵抗、胰島素分泌不足等人類2型糖尿病的特征。同時由于GK大鼠血糖比較穩定且死亡率極低，因而常被用于糖尿病及其并發癥的研究，故此本研究選用之。

GK大鼠尾靜脈注射伊凡思藍后，隨著血液循環伊凡思藍可到達視網膜血管。倘若血-視網膜屏障被破壞，可引起血管通透性增加，血管內液體及白蛋白等大分子就會滲漏到組織間隙。本實驗采取尾靜脈注射EB并循環2h后，通過檢測由視網膜毛細血管內滲漏到組織間隙的EB含量，可以比較精確地發現早期糖尿病大鼠視網膜病變中血-視網膜通透性的改變。張富文[2]采用 STZ大鼠觀察血-視網膜屏障的變化發現，造模后2周、1月、2月、3月、4月、5月和6月存在著明顯的視網膜滲漏情況，與正常對照組比較差異顯著，且隨病程的增加滲透量逐漸增多，造模后3月有明顯增多的趨勢，造模后6月組織滲透量約為24.7ng/mg。本實驗 9月(36周齡)GK大鼠的組織滲透量約為12.2ng/mg，較 STZ大鼠滲透量低，考慮與大鼠的種屬及血糖情況有關。而本實驗中通過與正常對照組比較，GK大鼠的EB含量顯著增加，差異有統計學意義。由此可見，36周齡的GK大鼠存在著明顯的血-視網膜屏障損傷。

本研究采用當歸補血湯加味治療GK大鼠，其EB含量與模型組比較顯著下降，由此說明當歸補血湯加味對血-視網膜屏障的滲漏有一定的保護作用。血-視網膜屏障能夠保證血液在血管中的正常運行及營養物質的正常輸送，防止血管內物質外滲。而中醫認為，氣的固攝作用包括氣對血、津液、精液等液態物質的統攝，防止其無故流失。若氣的固攝作用減弱可導致血管內血液溢出脈外，因而血-視網膜屏障緊密連接的破壞可以認為是氣的固攝作用減弱的一種表現。而氣虛則化生血液的功能減弱，易于出現血虛的病變;氣虛則氣的推動作用亦不足，則可見血運遲緩甚或停滯脈中，易于出現血瘀的病變，從而形成氣血虧虛、血瘀絡阻的病理特點。我們采取益氣養血、活血通絡的當歸補血湯加味進行治療，發現其對GK大鼠血-視網膜屏障的損傷具有保護作用。

[1]Harhaj N S and Antonetti D A.Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology[J].International Journal of Biochemistry and Cell Biology，2004，36(7):1206-1237.

[2]張富文.中藥部位復方DGH對STZ誘發糖尿病大鼠血視網膜屏障和視功能影響的實驗研究[D].四川:成都中醫藥大學，2005:40.