海南尖峰嶺野生靈芝菌種培養基配方篩選*

陳 友 胡佳娟 陳勇敢

（1.瓊州學院，海南 三亞 572022；2.三亞市第二中學，海南 三亞 572000）

海南尖峰嶺野生靈芝菌種培養基配方篩選*

陳 友1胡佳娟2陳勇敢1

（1.瓊州學院，海南 三亞 572022；2.三亞市第二中學，海南 三亞 572000）

以瓊州學院靈芝栽培培養基配方為基礎，對海南尖峰嶺兩種野生靈芝的一、二、三級菌種的培養基配方進行篩選試驗結果，一級種較優培養基為PDA+1/4MS（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、1/4MS培養液、20 mL的1/4MS培養基）；二級種的較優培養基為Y1005（木屑78％、麥麩或米糠20％、蔗糖1％、石膏1％，含水量50％～60％），三級種的較優培養基為Y3102（木屑73％、黃豆粉5％、麥麩20％、蔗糖1％、石膏1％，含水量60％～65％）。

海南；野生靈芝；培養基；配方；篩選

靈芝（Ganoderma lucidum）[1]素有“仙草”、“瑞草”之稱，古今藥理與臨床研究均證明其有防病治病、延年益壽的功效。

靈芝屬擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝屬[2]，主要生長在雨林、山坡草地和海濱紅樹林中腐朽的樹干、樹根或木樁上[3]。我國地跨熱帶至寒溫帶，靈芝科種類多而分布廣[2]，計有78種，分屬4屬、3亞屬、2個組[4]，以海南島分布種類最多，占全國靈芝科的53.6％[2]。

靈芝豐富的生物活性成分決定了其功能的多樣性[5]。目前已分離到靈芝的150余種活性成分，有多糖類、核苷類、生物堿類、氨基酸、蛋白質類、三萜類和礦質元素[6]等。其中，靈芝多糖能提高機體免疫力、刺激干擾素的形成，同時能提高機體抗病毒、抗氧化、抗腫瘤[7]、耐缺氧等多方面的功能[8]，還能有效地促進肝臟、骨髓、血液中DNA 、RNA和蛋白質的合成，從而達到益壽延年的功效[9]；靈芝中所含有的纖維素可在大腸中脫水，能有效地防止便秘，還可降低膽固醇，預防動脈粥樣硬化等；從靈芝粗脂肪中分離出的三萜類物質，具有止痛、鎮靜、解毒、保肝、抑制組織胺釋放、毒殺腫瘤細胞等多種功效，而其藥理藥效對人體無任何副作用[10]。

野生靈芝品種的馴化研究是資源利用中不可或缺的一環。筆者選擇海南尖峰嶺不同原生境的兩種野生靈芝作為材料，以瓊州學院靈芝培養基配方為基礎，優化一級、二級、三級菌種的培養基配方，用以培育優良菌種，供后期人工栽培。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料是兩株生長于海南省尖峰嶺地區不同原生境的野生靈芝。將黃邊靈芝（Ganoderma luteomarhinatum）編號4-3，咖啡網孢芝（Humphreya coffeatum)編號4-5。

1.2 試驗方法 培養基供試配方見表1。

（1）一級種（母種）培養。以配制100 mLPDA培養基為例說明。首先按配方稱量各種原料的1/10，加水適量，加熱后濾液，加水至100 mL。加瓊脂煮溶，補水至100 mL的濾液置于250 mL錐形瓶內，于121 ℃下滅菌20 min。然后，將滅好菌的培養基分成9個平板，貼標簽。其他3種培養基中1/2MS、1/4MS和1/10MS培養基是由標準MS培養基分別稀釋至2倍、4倍和10倍后加入。

表1 靈芝一、二、三級菌種的培養基試驗配方

過夜待平板內水分被培養基完全吸收后，分別接入兩種靈芝菌種，每個菌種每種培養基接3個平板，并做好標記。用保鮮膜將平板封緊，背面以所接菌種為原點，畫兩條相互垂直的線，記作A、B，每兩天記錄一次各平板A、B線上菌絲圈的直徑大小，累計7次，歷時14天。通過數據的相關統計分析，確定兩種靈芝各自最佳的生長配方。最后以最佳者為一級種接種到二級培養基上進行培養。

（2）二級種的培養。根據配方配制所需培養基。以Y1004為例，首先按比例稱取各原料并攪拌均勻，邊攪拌邊加水，含水量約60％，以手用力抓料，指縫中無水滴出但松手后手掌濕潤為宜。培養料裝瓶（15瓶）后，貼上標簽，將料瓶及其他用具于121 ℃下滅菌120 min后，及時轉移至接種室，待溫度降至室溫后進行接種并在標簽紙上注明所接菌種的編號及接種日期。

將培養瓶置于25 ℃下培養并適時記錄菌絲的生長高度。滿瓶后，分別以時間、高度、長勢為依據計算、分析、比較各靈芝菌株在不同培養基上的生長速度，取最佳者作為二級種接種到三級培養基上。

（3）三級種的培養。三級種采用栽培袋培養，試驗步驟與二級種基本相同。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對靈芝一級種菌絲生長的影響由表2、圖1可知，靈芝4-3號的一級種菌絲在培養基PDA+1/4MS上的生長速度較快，長勢較好；而靈芝4-5號菌絲在培養基PDA+1/2MS和PDA+1/4MS上生長快，長勢好。綜合4-3號和4-5號的一級種生長情況，認為PDA+1/4MS培養基為一級種的較優培養基配方。

2.2 不同培養基對靈芝二級種菌絲生長的影響由表2可知，靈芝4-3、4-5的二級種在培養基Y1005上菌絲生長速度快，密度大，為兩個菌種的二級種最佳培養基配方。所以，均以Y1005培養基上的菌落作為菌種接種到三級種培養基上。

2.3 不同培養基對靈芝三級種菌絲生長的影響由表2、圖2可知，靈芝4-3、4-5的三級種的菌絲均在培養基Y3102上生長速度快，且菌絲濃密，長勢良好；在培養基Y3101上菌絲前期長勢良好，但后期生長停滯并出現明顯的黃化現象。

表2 靈芝一、二、三級種在不同培養基上菌絲生長情況

3 討 論

圖1 不同培養基中靈芝一級種菌絲生長狀況

圖2 不同培養基中靈芝二級種菌絲生長情況

3.1 試驗中較適母種培養基配方是以PDA培養基配方為基礎，加入MS母液進行梯度篩選，結果靈芝4-3號、4-5號的一級種在培養基PDA+1/4MS上的生長速度及長勢均很好。此配方既適合栽培種也適合野生種，可作為一級種培育的首選配方。試驗中靈芝4-5號在培養基PDA+1/2MS上也具有較佳生長速度，這說明野生靈芝不同品種的一級種配方還存在進一步優化的空間。

3.2 兩個野生靈芝菌株二級種在Y1005培養基上均具有較佳長勢。4種培養基配方均以木屑為主料，試驗結果差異主要在于輔料。所有的植物組織培養基都需要有碳水化合物作為能源，蔗糖作為組織培養的碳源則具有普遍性和廣泛性。兩個菌株在Y1005麥麩培養基中菌絲生長速度快、菌絲濃密，而在Y1004玉米粉培養基中菌絲長速較慢、長勢較差。分析原因是麥麩顆粒較松散，培養料內氧氣量充足，較適宜菌絲生長；而玉米粉顆粒間空隙小，菌種培養過程放置時間長易吐黃水，不利于菌絲生長。Y1005、Y1006的差異還在于Ca2+的存在形式，試驗表明石膏中的Ca2+較過磷酸鈣更利于靈芝吸收，且更經濟，更具有可取性。

3.3 研究表明，主料中添加麥麩等含氮量高的輔料會明顯提高靈芝產量，添加量為20％時產量較高[11]。兩個靈芝菌株三級種在Y3102黃豆粉培養基上較Y3101玉米粉培養基生長速度快，菌絲濃密，這主要與黃豆粉較松散，利于菌絲生長有關。

參考文獻

[1] 趙繼鼎.中國靈芝科的分類研究Ⅺ.靈芝亞屬靈芝組[J].真菌學報, 1989, 8(1): 25-34.

[2] 賈定文,鄭林用. 靈芝屬真菌分類研究現狀及分析[J].西南農業學報,2003,16:64.

[3] 葉向花,楊勇岐. 靈芝栽培新技術[J].現代農業科技2007,16:46.

[4] 吳興亮. 中國海南島靈芝資源及其分布特征 [J]. 菌物系統, 1998, 17(2)：

[5] YUE Qing-Xi,GUAN Shu-hong et. Interaction of Ganoderma Triterpenes with Docetaxel and Cisplatin in Cytotoxicity against Human Carcinoma Cells[J]. Chinese Journal of Natural Medicines,2008,6(5):367-371.

[6] R.Saltarelli et. Food Chemistry[J].contents lists available at Science Direct Food Chemistry ,2009: 143-151.

[7] Xiao-Ling Zhu, Alex-F. Chen, Zhi-Bin Lin. Ganoderma lucidum polysaccharides enhance the function of immunological effector cells in immunosuppressed mice [J].Journal of Ethnopharmacology, 2007 (111) :219–226.

[8] 毛健，馬海樂. 靈芝多糖的研究進展[J].食品科學，2010, 31(1): 295-299.

[9] 豐永紅,于淑娟. 一種生理活性物質靈芝多糖[J].武漢工業學院學報,2002,19(3):19-21.

[10] 劉存芳. 靈芝營養成分綜述[J]. 南江科技, 2008(5):20, 122-129.

農業部熱帶種質資源保護項目《香蕉種質資源調查與收集》（12RZZY-47）；瓊州學院青年教師科研基金項目《海南野生香蕉馴化研究》（No.QY200917）；三亞市院校專項資金項目《海南野生靈芝馴化研究》（No.YD09041）。

陳友(1975-)，男，講師，主要從事香蕉種質資源多樣性及遺傳關系研究，E-mail:342389998@qq.com。