金屬硫蛋白3對快速老化癡呆小鼠海馬膠原纖維酸性蛋白表達的影響

馬飛煜 蔡君賢 陳曉燕 田賢先

(汕頭市中心醫院暨中山大學附屬汕頭醫院神經內科，廣東 汕頭 515041)

阿爾茨海默病(AD)發病前提是腦的衰老，在腦衰老過程中，星形膠質細胞在形態和代謝方式上均發生很多變化，從而加重神經元損傷，導致神經功下降。膠原纖維酸性蛋白(GFAP)是一種僅存在于星形膠質細胞的膠原纖維中間絲，是該種細胞的特異性標記物〔1〕。GFAP變化可以反映星形膠質細胞的形態變化?？焖倮匣V呆模型小鼠SAMP8是目前公認的比較理想的自然衰老癡呆模型〔2～5〕，主要以學習記憶能力障礙為老化特征，其壽命約為12.1個月。SAMR1作為SAMP8的正常對照，表現為正常衰老。金屬硫蛋白3(MT3)只在中樞神經系統特異表達，具有特定條件下發揮生長抑制因子、調節微量金屬元素代謝、清除自由基等作用〔6〕。相關研究發現AD患者腦中MT3含量明顯減少〔7〕，而GFAP表達增加，本實驗研究二者之間表達是否有關聯，采用SAMP8小鼠為癡呆模型，檢測外源性MT3作用于SAMP8小鼠后海馬結構GFAP的表達變化。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑及儀器 一抗(兔抗鼠GFAP多克隆抗體)，二抗(生物素化羊抗兔 IgG/Biotin)由Santa Cruz公司提供。MT3由北京大學生命科學院蛋白質工程實驗室惠贈。Image-pro plus圖像分析系統。

1.2 實驗動物分組 SAMR1小鼠作為正常組。將SAMP8小鼠(7月齡)隨機法分成5組:癡呆組、對照組(生理鹽水，0.2 ml/10 g)、低、中、高濃度 MT3 組(75、150、300 μg/ml)。每組10只。由天津中醫學院第一附屬醫院實驗動物中心提供。連續28 d腹腔注射給藥，停藥1 d后進行實驗。

1.3 免疫組化法染色海馬GFAP陽性細胞 各組小鼠用4%多聚甲醛灌注取腦，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明后，浸蠟，石蠟包埋制成蠟塊。海馬區石蠟切片，脫蠟和脫水。1%H2O2滅活內源性過氧化物酶。枸櫞酸鹽緩沖液修復抗原，正常山羊血清封閉非特異性抗原。滴加一抗、二抗，滴加Streptavidin-HRP溶液。DAB顯色，蘇木精復染，中性樹脂封片。對照用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 免疫印跡法檢測海馬GFAP水平 小鼠處死后，取海馬組織置于4℃預冷的組織裂解緩沖液中勻漿，12 000 r/min離心后取上清。用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后將凝膠中的蛋白轉移到PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加一抗(1∶1 000)4℃ 過夜。PBST洗膜4次，每次7 min。加二抗(1∶3 000)室溫1 h，PBST洗膜4次，每次7 min。最后用超敏發光液化學發光、顯影、定影。

1.5 圖像分析及統計學分析 應用Image-pro-plus圖像分析系統進行免疫組化圖片光密度(IOD)值分析。Image-J分析軟件對免疫印跡結果進行灰度定量分析。數據以±s表示，用SPSS10.0統計軟件進行多組間方差檢驗和兩組間t檢驗。

2 結果

2.1 各組小鼠海馬結構GFAP的表達 GFAP陽性的星形膠質細胞形態如蜘蛛狀，周圍有放射狀突起，突起相互交織成網，并伸入到錐體細胞及顆粒細胞層神經元間，胞質呈紅棕色。癡呆組海馬結構內可見大量濃染的GFAP陽性星形膠質細胞，體積肥大，突起密集、粗長，胞質和突起著色較深。正常組海馬結構內的GFAP陽性星形膠質細胞較少，細胞體積較小，突起短細，胞質和突起著色較淺。癡呆組〔(20.59±1.96)×106〕和正常組〔(12.49±1.43)×106〕組間GFAP陽性星形膠質細胞的IOD值差異有統計學意義(P＜0.01)。隨著給予MT3濃度的增加，癡呆組海馬結構內的GFAP陽性星形膠質細胞減少，突起短細，細胞體積較小，著色較淺。高濃度MT3組的GFAP陽性細胞最少，IOD值差異有統計學意義(P＜0.05)。高濃度MT3組〔(13.58±1.61)×106〕與正常組比較，IOD值稍多，差異無統計學意義。高濃度MT3組、中濃度MT3組〔(15.49±1.62)×106〕較對照組〔(19.56±1.45)×106〕明顯降低(P ＜0.05)，低濃度MT3組為〔(17.94±1.54)×106〕。說明MT3有抑制星形膠質細胞生長，體現出生長抑制的作用。

2.2 各組小鼠海馬結構GFAP的表達 與正常組相比，癡呆組小鼠海馬GFAP含量增加90%(P＜0.01)。3種濃度MT3處理后的癡呆組小鼠海馬結構的GFAP表達量均下降，高濃度組下降40%左右。與對照組相比差異顯著(P＜0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠海馬GFAP表達的Western印跡結果

3 討論

星形膠質細胞在神經元發育、突觸傳遞、神經組織的修復和再生起著十分重要的作用，神經元的活動也影響星形膠質細胞的功能。星形膠質細胞含有一種特異性標記物——GFAP，它是一種僅存在于該細胞的膠原纖維中間絲蛋白。GFAP表達量的增加反映了星形膠質細胞的增生和活化。當各種原因導致星形膠質細胞腫脹時，其突起增多，延長，GFAP表達明顯增多。過度活化的星形膠質細胞可以釋放腫瘤壞死因子(TNF)、白介素、干擾素等有害因子導致遲發性神經元死亡;一氧化氮、細胞因子IL-6、載脂蛋白J(SP40)、α2-巨球蛋白、集落刺激因子如粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)等亦會損害神經末梢，導致斑塊炎癥改變和神經元纖維纏結(NFT)的形成，加速受損神經元的凋亡和導致癡呆〔8，9〕。本實驗結果說明SAMP8小鼠較SAMR1小鼠海馬結構星形膠質細胞的GFAP的過度表達，可能是導致癡呆的重要因素之一。

MT3于1991年首次被發現，它只在中樞神經系統特異表達。MT3具有特定條件下發揮生長抑制因子、清除自由基、調節微量金屬元素代謝等作用。MT3的生長抑制功能最早是基于MT3在AD腦提取物的存在下對培養的神經元細胞生長具有抑制作用，因而最初將其命名為生長抑制因子〔10〕。本實驗說明MT3有減少GFAP的表達，抑制星形膠質細胞活化的作用，間接起到神經元的保護作用，從而對AD有一定治療作用。

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3 Nomura Y，Okuma Y.Age-related defect s in lifespan and learning ability in SAMP8 mice〔J〕.Neurobiol Aging，1999;20:111-5.

4 Han S，Rudd JA，Hu ZY，et al.Analysis of neuronal nitric oxide synthase expression and increasing astrogliosis in the brain of senescence-accelerated-prone 8 mice〔J〕.Int J Neurosci，2010;120(9):602-8.

5 Fernández-Gómez FJ，Mu?noz-Delgado E，Montenegro MF，et al.Cholinesterase activity in brain of senescence-accelerated-resistant mouse SAMR1 and its variation in brain of senescence-accelerated-prone mouse SAMP8〔J〕.J Neurosci Res，2010;88(1):155-66.

6 Manso Y，Carrasco J，Comes G，et al.Characterization of the role of metallothionein-3 in an animal model of Alzheimer's disease〔J〕.Cell Mol Life Sci，2012;69(21):3683-700.

7 Yu WH，Lukiw WJ，Bergeron C，et al.Metallothionein is reduced in Alzheimer's disease〔J〕.Brain Res，2001;894:37-45.

8 Webb P，Nguyen P，Valentine C，et al.The estrogen receptor enhances AP-1 activity by two distinct mechanisms with different requirements for recept or transactivation functions〔J〕.Mol Endocrinol，1999;13(10):1672-1685(Suppl 2):S4-8.

9 Rohn TT，Catlin LW，Poon WW.Caspase-cleaved glial fibrillary acidic protein within cerebellar white matter of the Alzheimer's disease brain〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2013;6(1):41-8.

10 Uchida Y，Ihara Y.The N-terminal portion of growth inhibitory factor is sufficient for biological activity〔J〕.J Biol Chem，1995;270(7):3365-9.