缺氧誘導因子-1α和同源盒基因表達對血管細胞信息傳遞連接生成的影響

高 雪 楊 鏞(昆明市第一人民醫院干療科，云南 昆明 650000)

缺氧誘導因子(HIF)-1α與同源盒(gax)基因是參與血管內皮細胞(VEC)和血管平滑肌細胞(VSMC)增殖的主要相關基因〔1〕。VEC與VSMC連接結構是二者之間相互傳遞信息的重要通路〔2〕。本研究探討 HIF-1α與gax基因表達水平對VECVSMC細胞連接生成的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 Wistar大鼠20只，雌雄不拘，體重(250±40)g，由中國醫科大學實驗動物部提供。隨機分為對照組和實驗組，每組10只。

1.2 動物模型制作及標本收集 兩組實驗動物均行自體靜脈移植術。10%水合氯醛腹腔麻醉，切取4 mm大鼠右頸內靜脈，其中，實驗組切取下的靜脈置于高滴度的含有HIF-1αcDNA的重組腺伴隨病毒(rAAV)工作液中(rAVV-HIF-1α為2×1011v.g/ml)，0～4℃下體外孵育45 min;而對照組切取的靜脈僅用空載rAAV工作液處理，0～4℃下體外孵育45 min，兩組切取的靜脈均與對側頸總動脈端端吻合，術后分籠標記統一飼養。術后14 d時，在麻醉下切取大鼠移植靜脈。每組動物分別隨機選擇6只大鼠的移植血管，即刻置于液氮，于-70℃冰箱中保存，用于RT-PCR;4只大鼠移植血管置2.5%戊二醛中固定，4℃保存，用于電鏡觀察。

1.3 RT-PCR 總RNA提取(Trizole液，Sangon)，紫外分光光度計(A260/A280)檢測RNA純度。總RNA 1μl，逆轉錄反應體積20μl(美國Promega公司產品)，逆轉錄合成的cDNA于-20℃下保存。HIF-1α 引物設計參照文獻〔3〕，HIF-1α(568 bp，上海生物工程公司)上游引物5'-TGAGGCTCACCATCAGTTAT-3'，下游引物 5'-TAACCCCATGTATTTGTTC-3'，β-actin 為內參照，上游引物 5'-ATTGTAACCAACTGGGACG-3'，下游引物5'-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3'，擴增產物640 bp。PCR擴增體系50 μl。擴增條件為 94℃ 2 min，1 個循環;95℃ 15 s，55℃30 s，72℃ 30 s，28個循環，接 72℃后延伸 5 min。采用自動電泳凝膠成像分析儀(Chem Imager 5500，USA)及分子分析軟件進行圖像掃描和分析。HIF-1α積分灰度值/β-actin積分灰度值，所得值為HIF-1αmRNA相對表達值。gax引物由中國醫科大學分子遺傳學研究室設計，上游引物:5'-CCCGCGCGGCTTTTACATTAGGAGT-3'，下游引物:5'-GCTGGCAAACATGCCCTCCTCATTG-3'(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)，擴增產物片段為300 bp。

1.4 Western印跡檢測HIF-1α和gax蛋白表達 HIF-1α和gax單克隆抗體(BOSTER生物工程公司提供)。操作均按說明書進行。

1.5 透射電鏡觀察 移植靜脈5～6塊，每塊1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm，2.5%戊二醛前固定，緩沖液漂洗，1%鋨酸后固定，30%、50%和70%酒精及80%、90%和100%丙酮逐級脫水，浸透包埋，聚合，修塊，LKB-V型超薄切片機制作超薄切片(50～70 nm/片)，以醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛雙重染法行電子染色，H-600型透射電鏡(HITACHI，Japan)觀察VSMC超微結構。連續計數 200個 VSMC，其中合成型 VSMC與收縮型VSMC數量用百分比表示。

2 結果

2.1 二組HIF-1α和gax mRNA和蛋白表達水平 靜脈移植術后14 d，在568 bp處可見兩條HIF-1αmRNA的RT-PCR表達產物。實驗組HIF-1αmRNA表達明顯高于對照組(P均＜0.01)。見表 1，圖 1，圖 2。

2.2 兩組大鼠移植靜脈透射電鏡觀察結果 移植靜脈術后14 d，對照組中少見增生的VEC-VSMC細胞連接的超微結構，VSMC排列欠規整。實驗組中VEC增生顯著，VSMC排列較規整，VEC-VSMC細胞連接重建顯著，中間型(又稱為過渡型)和收縮表型VSMC居多(P均＜0.01)。見表2，圖3。

表1 兩組HIF-1α和gax mRNA和蛋白表達水平(x ± s，n=6)

表2 移植靜脈VSMC增殖狀態檢測結果(x ± s，n=4)

圖1 兩組HIF-1α和gax mRNA RT-PCR表達產物

圖2 兩組HIF-1α、gax蛋白免疫印跡雜交結果

圖3 術后14 d實驗組移植靜脈超微結構(×6 000)

3 討論

對血管組織中的VEC-VSMC細胞連接的認識大約經歷了三個時期:二十世紀80年代中期提出肌內皮連接結構的概念;繼之于90年代中期證明VEC與VSMC之間通過各自胞漿突出延伸可形成一種可傳遞信息的連接結構;二十一世紀初期通過部分學者對這一連接結構的諸多描述而逐漸將這一結構定性和定量化。所謂VEC-VSMC細胞連接是指在顯微鏡下觀察到血管組織中VSMC與VEC之間有突起的胞漿，該VSMC胞漿穿過內彈力板上的許多小孔到達VEC并與VEC胞漿結合，形成一種厚約15 nm的間隙連接，這種連接可允許分子量小于1 000的水溶性分子通過，使VSMC能有效接受VEC產生的第二信息，從而對VSMC本身的收縮表型狀態起到穩定作用。因此也將VEC-VSMC細胞連接稱之為肌-內皮連接耦系統。在血管外科領域，所關心的是在活體組織中，如果這一耦聯系統受損，近內側彈力膜處VSMC是否可自收縮表型轉變為合成表型狀態，因為合成表型VSMC是參與并導致血管內膜的過度增生(IH)從而引起血管腔狹窄主要細胞。從本研究所采用的靜脈移植動物模型中通過電鏡觀察到，移植靜脈中肌內皮連接結構因人為造成的對血管的牽拉和血管自身的缺血缺氧等因素的作用，VEC與VSMC之間的連接消失。并且，VEC受損或脫落，合成表型VSMC較收縮表型VSMC相對增多。肉眼條件下即可觀察到移植靜脈管腔顯著狹窄。因此推測出肌內皮連接耦聯系統應是影響VSMC表型轉化態的重要結構之一。就移植靜脈而言，在移植早期重塑這一結構，對VSMC收縮表型的穩定或合成型的轉態應能發揮重要的生物效應。本研究在基因轉染的移植靜脈早期，有VEC-VSMC細胞連接形成。這一研究結果表明，VEC-VSMC細胞連接這一信息通路是穩定移植靜脈重塑早期VSMC轉化態重要的組織結構之一。

1 溫進坤，石 纓.血管平滑肌細胞增殖調控機理的研究進展〔J〕.物理學進展，1996;27(2):149-52.

2 SongW.Phecotypic changes of vascular smooth muscle cells and their fuction significance〔J〕.Med Invest Communi，1993;22(4):10-3.

3 Saito Y.Mechanism of phenotypic formation of smooth muscle cells〔J〕.Ann N Y Acad Sci，1995;748(1):7-10.

4 Kocher O，Gabbiani G，Reidy MA，et al.Phenotypic feature of smooth muscle cells during the evolution of experimental carotide artery intimal thickening.Biochemical and morphological studies〔J〕.Lab Invest，1991;65(4):459-70.