HPLC-ELSD法測定青葙子中青葙苷I

王玉梅， 喻 悅， 李會軍

（天然藥物活性與藥效國家重點實驗室，中國藥科大學，江蘇南京 210009）

HPLC-ELSD法測定青葙子中青葙苷I

王玉梅， 喻 悅， 李會軍*

（天然藥物活性與藥效國家重點實驗室，中國藥科大學，江蘇南京 210009）

目的 建立青葙子中青葙苷I的HPLC-ELSD測定方法。方法 以Shim-pack CLC-ODS（6.0 mm×150 mm，5 μm）色譜柱為固定相，以乙腈-水 （0.1%甲酸）為流動相，梯度洗脫，體積流量1 mL/min，蒸發光散射檢測器檢測。結果 青葙苷I在0.4～6.4 μg范圍內，進樣量的對數值與峰面積的對數值之間有良好的線性關系 （Y=1.045 5X+7.278 5，r2=0.999 4），平均回收率為98.7%，RSD為2.6%（n=9）；測得10批青葙子藥材中青葙苷I的量為0.166 7%～0.313 2%。結論 所建立的HPLC-ELSD測定方法靈敏度高，重復性好，結果準確可靠，可用于青葙子質量控制。

青葙子；高效液相色譜蒸發光散射檢測法；青葙苷I

青葙子為莧科Amaranthaceae一年生草本植物 青葙Celosia argentea L.的干燥成熟種子，具清肝、明目，退翳之功效［1］。研究［2-7］發現青葙子所含的三萜皂苷類成分青葙苷A ～G（celosin A ～G）、雞冠花苷 （cristatain）等具有保肝、抗腫瘤等藥理活性，是青葙子的主要藥效成分。文獻［8］曾采用高效液相色譜蒸發光散射檢測法 （HPLC-ELSD）測定了青葙子中青葙苷A和青葙苷B的量。

2010年版《中國藥典》收載的青葙子藥材質量標準，尚缺少【含量測定】項。為提高青葙子質量控制水平，本課題組對青葙子進行化學成分研究，發現青葙苷I（celosin I）是青葙子中主要的皂苷類成分 （相關研究結果另文發表）。在此基礎上，本研究建立了青葙子中青葙苷 I的 HPLCELSD定量測定方法，以期為青葙子的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（美國Agilent公司，包括G1311A二元泵、G1313A自動進樣器、G1314A VWD檢測器、Chemstation 6.01色譜工作站）；HS3120型超聲波提取器 （300 W，100 kHz，中國昆山禾創超聲儀有限公司）；Sartorius BT224S電子天平 （十萬分之一，德國Sartorius公司）；METTLER TOLEDO XS105電子天平 （百萬分之一，瑞士METTLER TOLEDO公司）；MUL—9000Series超純水系統 （美國 Millipore公司）。

1.2 試藥 實驗共收集10批青葙子樣品 （QXZ-1～QXZ-10），各批藥材經中國藥科大學生藥學與藥用植物學教研室李會軍教授鑒定為莧科植物青葙Celosia argentea L.的干燥成熟種子，憑證標本保存于天然藥物活性與藥效國家重點實驗室（中國藥科大學）。青葙苷I對照品由本實驗室制備，經HR-ESI-MS、1D-、2D-NMR鑒定結構 （圖1），經HPLC-ELSD法測定純度達98.5%以上。乙腈為色譜純，水為去離子水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品貯備液的制備 精密稱取青葙苷I對照品1.94 mg，置5 mL量瓶中，加水溶解，定容，搖勻，即得0.388 mg/mL的青葙苷I對照品貯備液。

圖1 青葙苷I的結構式Fig.1 Structure of celosin I

2.1.2 供試品溶液的制備 取干燥至恒定質量的青葙子粉末 （過40目篩）約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，稱定，熱回流提取1 h，放冷，補足失質量，濾過，取續濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加水溶解并轉移至5 mL量瓶中，定容，搖勻，過0.45 μm的微孔濾膜，取續濾液為供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統適用性實驗 Shim-pack CLC-ODS色譜柱 （6.0 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈 （A）-0.1%甲酸 （B），梯度洗脫，0～5 min（20%A），5 ～ 10 min（20%→30%A），10～20 min（30%→36%A），20～27 min（36%A），27～30 min（36%→100%A），30～35 min（100%A）；體積流量1 mL/min；蒸發光散射檢測器漂移管溫度105℃，載氣體積流量2.8 L/min。在該色譜條件下，青葙苷I色譜峰的分離度大于1.5（見圖2）。

圖2 對照品和樣品的色譜圖Fig.2 Chromatogramsofreference substances and sample

2.3 專屬性考察 采用液質聯用的方法進行專屬性考察，色譜分離按2.2項色譜條件，檢測器采用Agilent 1100 series LC/MSD系統 （Agilent，Germa-ny），電噴霧 （ESI）離子源。質譜檢測條件為：Scan mode（m/z 100～1 500），負離子模式，氮氣體積流量為9.0 L/min，干燥氣體溫度為320℃，霧化壓力35 psig（1 psig=68 194.8 Pa），毛細管電壓3 500 V。結果表明，在選定的色譜條件下，青葙苷I色譜峰為單一成分，空白溶劑及樣品中其他成分無干擾。見圖3。

圖3 空白溶劑、對照品及樣品總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of black，reference substance and sample

2.4 線性關系考察 制備一定質量濃度對照品溶液并稀釋得到6個質量濃度的對照品稀釋溶液（分 別 為 0.640、0.384、0.320、0.160、0.080、0.040 mg/mL）。按2.2項色譜條件，每個質量濃度進樣10 μL，測定峰面積，以進樣量的對數值為橫坐標，峰面積的對數值為縱坐標，繪制標準曲線，并以最小二乘法計算得回歸方程：Y =1.045 5 X+7.278 5（r2=0.999 4），表明青葙苷I在0.4～6.4 μg范圍內，進樣量的對數值與峰面積的對數值之間呈良好的線性關系。

2.5 檢測限及定量限測定 按2.2項色譜條件，首先進樣空白溶劑，測出對照品出峰位置的基線噪音水平。再進樣線性測定中濃度最低的青葙苷I對照品稀釋溶液，根據其對應的峰高值，將此溶液稀釋至約3倍信噪比的濃度 （S/N=3），即為檢測限 （LOD）；約10倍信噪比的濃度 （S/N=10）即為定量限 （LOQ），結果青葙苷I LOD為0.272 μg，LOQ 為 0.466 μg。

2.6 精密度試驗 取青葙苷I對照品貯備液（0.388 mg/mL），于一天之內重復進樣6次，測定峰面積，計算RSD值為2.6%（n=6），作為日內精密度；連續進樣3 d，每天進樣3次，測定峰面積，計算RSD值為2.8%（n=9），作為日間精密度；實驗室另一操作人員按2.3項制備供試品溶液，按2.2項色譜條件測定青葙子粉末中青葙苷I的量，每個樣品連續進3次，測定，計算RSD值為2.8%（n=6），作為中間精密度。結果表明精密度良好。

2.7 重復性試驗 取同一批次青葙子粉末 （QXZ-1）6份，每份1 g，精密稱定，按2.3項制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，計算青葙苷 I含有量為 （0.233 0 ±0.005 7）%，RSD值為3.1%（n=6）。結果表明，該方法重復性較好。

2.8 準確度試驗 取已準確測定含有量的青葙子粉末 （QXZ-1）約0.5 g，共9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入高、中、低質量濃度 （分別為1.342、1.170、0.944 mg/mL）的對照品溶液適量，按2.3項方法制備供試品溶液，按2.2項色譜條件檢測，計算加樣回收率。結果表明，高、中、低三個質量濃度的加樣回收率均在95%～105%范圍內，RSD為2.6% （結果見表1）。

表1 青葙子中青葙苷I的加樣回收率Tab.1 Recovery tests of celosin I in Celosiae Semen

2.9 耐用性考察

2.9.1 穩定性試驗 取青葙子粉末1 g，精密稱定，按2.3項制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄峰面積并計算RSD值為2.8% （n=6），結果發現穩定性良好。

2.9.2 不同色譜柱的考察 采用Agilent1100系列高效液相色譜儀，考察了3種類型C18色譜柱對分離度的影響，結果發現青葙苷I均能得到較好的分離 （如圖4所示）。

圖4 不同色譜柱的色譜圖Fig.4 Chromatograms of different columns

3 樣品測定

取青葙子樣品，按2.3項方法制備供試品溶液，按2.2項色譜條件，分別精密吸取對照品貯備液5 μL、10 μL，供試品溶液 10 μL，注入液相色譜儀，測定，按外標兩點法對數方程計算青葙苷I量。10批青葙子測定結果見表2。

表2 不同產地青葙子中青葙苷I測定結果 （n=3）Tab.2 Contents of celosin I in different samples（n=3）

4 討論

皂苷常用的定量方法主要為高效液相色譜法（HPLC），所用檢測器有紫外檢測器 （UV）和蒸發光散射檢測器 （ELSD）。由于皂苷類化合物結構中缺乏共軛體系，因此在選用UV時常在末端吸收區進行檢測，易導致基線不穩。ELSD為質量通用型檢測器，其響應值與樣品的質量成正比，不依賴于樣品的光學特性，不受化合物官能團的影響，可消除流動相的配比變化對基線產生的影響，在皂苷類成分的分析中被廣泛應用［9-13］。本實驗對比UV（203 nm）和ELSD檢測，發現在采用梯度洗脫程序時前者基線漂移較大，不能準確定量目標成分；后者基線平穩，且靈敏度更高。故本實驗采用HPLC-ELSD法測定。

實驗對提取條件如提取溶劑、提取方式、提取時間進行考察，綜合考慮青葙苷I提取率、提取時間等因素，最終確定提取溶劑為50%甲醇，提取方式為加熱回流，提取時間為1 h。實驗還比較了Agilent Extend C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）、Innovation TMInfinite C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Shim-pack CLC-ODS（6.0 mm×150 mm，5 μm）等3種不同類型的色譜柱，結果在這3種類型色譜柱上青葙苷I均能得到基線分離，表明本實驗的色譜條件具有較好的適用性。

樣品測定結果表明10批青葙子藥材中青葙苷I的量在0.166 7%～0.313 2%之間，平均含有量為0.228 2%，高于文獻報道青葙苷A（0.051 2%～0.114 3%）和青葙苷B量（0.010 9% ～0.081 5%），故認為青葙苷I為青葙子的主要成分，可作為青葙子的質量控制指標。

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Assay of celosin I in Celosiae Semen by HPLC-ELSD

WANG Yu-mei， YU Yue， LI Hui-jun*
（State Key Laboratory of Natural Medicines，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

Celosiae Semen；HPLC-ELSD；celosin I

R284.1

A

1001-1528（2013）09-1957-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.09.029

2013-04-18

2010—2011年度國家藥品標準提高科研項目 （661）

王玉梅 （1986—），女，碩士生，主要從事中藥質量標準研究。Tel：18762407833，E-mail：mouyuzi@163.com

*通信作者：李會軍，男，教授，主要從事中藥活性成分與質量標準研究。Tel：（025）83271382/13813985884，E-mail：cpuli@163.com