超濾配合LC-MS/MS法測定普伐他汀人血漿蛋白結(jié)合率

謝展雄，陳桂紅，彭巧華，吳鐵松，溫中明（.深圳龍華新區(qū)觀瀾人民醫(yī)院，廣東 深圳 58000；.深圳寶安區(qū)西鄉(xiāng)人民醫(yī)院，廣東 深圳 58000；.深圳光明新區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 58000）

普伐他汀鈉（Pravastatin sodium，結(jié)構(gòu)見圖1 A）是一種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA還原酶）抑制劑，通過競爭性抑制膽固醇合成中的關(guān)鍵限速酶HMG-CoA還原酶從而影響羥甲基戊二酰輔酶A還原成羥甲戊酸（MVA），使膽固醇在肝細胞內(nèi)合成減少，適用于飲食限制仍不能控制的原發(fā)性高膽固醇血癥或合并有高甘油三酯血癥的患者（Ⅱa和Ⅱb型）[1-2]。由于肝臟是合成膽固醇的最主要場所，普伐他汀鈉因水溶性特點而對肝細胞具高度的選擇性，在膽固醇生物合成中發(fā)揮較強的HMG-CoA還原酶的抑制作用，從而明顯降低血中膽固醇含量[3]。但普伐他汀在血中蛋白結(jié)合率高，以蛋白結(jié)合型的藥物存在血中會影響其跨膜運轉(zhuǎn)，從而影響其在肝細胞中的分布。因此，普伐他汀血漿蛋白結(jié)合率對其臨床療效有一定影響。已有研究報道應(yīng)用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）法檢測人血中的普伐他汀鈉濃度[4-6]，但并未見LC-MS/MS法應(yīng)用于普伐他汀鈉血漿蛋白結(jié)合率研究，筆者現(xiàn)探討如下。

圖1 普伐他汀鈉和瑞舒伐他汀結(jié)構(gòu)式A.普伐他汀鈉；B.瑞舒伐他汀Fig 1 Structure of pravastatin sodium and rosuvastatinA.pravastatin sodium；B.rosuvastatin

1 材料

1.1 儀器

Waters Quattro Micro液-質(zhì)聯(lián)用儀，配有電噴霧電離（ESI）（美國Waters公司）；Waters 2695高效液相色譜儀，包括四元泵，PAD二極管陣列檢測器、自動進樣器、Masslynx 4.02工作站（美國Waters公司）；M37610-33渦旋混合器（美國Thermo Scientific公司）；Sigma 2-16 K臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；Sartorius BP 211 D型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；HGC-96 A氮吹儀（上海禾工科學儀器有限公司）；DK-S23型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；Milli-Q純水機（美國Millipore公司）；Amicon Ultra-30離心超濾管（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

普伐他汀鈉對照品（批號:20110612，純度＞98%）、瑞舒伐他汀（內(nèi)標，批號:20100609，純度＞99%，結(jié)構(gòu)式見圖1 B）均購于上海研晶生物科技有限公司；普伐他汀鈉片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號:20111026，規(guī)格:每片20 mg）。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱:Waters XTerra MS C18（150mm×2.1mm，5μm）；Waters Symmetry C18保護柱（20 mm×3.9 mm，5 μm）；流動相:甲酸銨（含0.2%甲酸）-乙腈（60∶40，V/V）；柱溫:40℃；流速:0.3 ml/min；全波長掃描。

ESI:正離子模式檢測；毛細管電壓:3.50kV；錐孔電壓:70.00 V；其人二級錐孔電壓:3.00 V；六級桿透鏡電壓:0.3 V；離子源溫度:100℃；脫溶劑氣溫度:350℃；錐孔氣流量:50 L/h；脫溶劑氣流量:450 L/h。選擇質(zhì)核比范圍:100～1500 m/z，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），檢測通道為普伐他汀鈉m/z 448.2→327.7和瑞舒伐他汀（內(nèi)標）m/z 483.2→258.6。數(shù)據(jù)由Masslynx 4.02（美國Waters公司）獲得和處理。普伐他汀鈉和內(nèi)標的離子掃描圖譜見圖2。

圖2 產(chǎn)物離子掃描圖譜A.普伐他汀鈉；B.瑞舒伐他汀Fig 2 Product ion scan spectraA.pravastatin sodium；B.rosuvastatin

2.2 標準溶液的制備

準確稱取普伐他汀鈉和內(nèi)標瑞舒伐他汀各1.0 mg，加甲醇分別溶解于100 ml量瓶中，作為儲備母液（普伐他汀鈉質(zhì)量濃度10.0 μg/ml，瑞舒伐他汀質(zhì)量濃度10.0 μg/ml），于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ∑辗ニ♀c儲備母液用甲醇依次稀釋成1.25、3.75、10.00、25.00、50.00、125.00 ng/ml系列濃度作為標準工作溶液，于4℃冰箱保存待用；將瑞舒伐他汀儲備母液稀釋成200.0 ng/ml作為工作溶液，于4℃冰箱保存待用。低、中、高3個（1.25、10.00、125.00 ng/ml）質(zhì)量濃度的普伐他汀鈉標準工作溶液作為質(zhì)控（QC）樣本以備后用。

2.3 血漿樣品的處理

健康志愿者給藥前抽取靜脈血5 ml作為空白對照；給藥后1、2、4、6、12、24 h時分別分部分抽取靜脈血5 ml，所取全血即時離心制備血漿，存儲于－20℃冰箱。待測血漿樣品從冰箱取出，于37℃解凍。A部分:微量加樣器精密吸取500 μl置離心超濾管中，12000 r/min離心10 min；濾液加內(nèi)標工作溶液100 μl，渦旋5 min，置另一離心管中，30℃水浴氮氣吹干；殘留物加流動相150 μl復溶，12000 r/min離心10 min，得上清液即為游離型藥物血漿樣品；吸取10 μl進樣分析。B部分:微量加樣器精密吸取500 μl置另一10 ml的離心管中，加內(nèi)標工作溶液100 μl，加入 100 mmol/L甲酸銨 100 μl，渦旋1 min，再加入叔丁基甲基醚5 ml，渦旋5 min，3000 r/min離心10 min；上清液置另一離心管中，30℃水浴氮氣吹干，殘留物加流動相150 μl復溶，12000 r/min離心10 min，得上清液即為總的藥物血漿樣品；吸取10 μl進樣分析。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線的制備和定量限考察:取空白血漿250 μl，加入普伐他汀鈉系列工作溶液50 μl，配成相當于普伐他汀鈉血漿濃度為0.25、0.75、2.00、5.00、10.00、50.00 ng/ml的血漿樣品，分別按“2.3”項下A部分和B部分方法處理，并進樣分析。記錄峰面積，以待測物濃度（x）為橫坐標，待測物與內(nèi)標的峰面積比值（y）為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法進行線性回歸，得游離型、總的藥物檢測的標準曲線方程分別為y＝0.0277123 x－0.0100645（r＝0.9995）、y＝0.0212767 x+0.0006445（r＝0.9985）。結(jié)果表明，普伐他汀鈉血藥濃度分別在0.25～50.00 ng/ml、25.00～50.00 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；定量限為0.25 ng/ml。

2.4.2 專屬性:分別將空白血漿、空白加樣、游離型血漿樣品和總藥物型血漿樣品分別按“2.3”項下相對應(yīng)的方法處理，進樣分析，結(jié)果見圖3。在MRM模式下，血漿中普伐他汀鈉和瑞舒伐他汀（內(nèi)標）能夠很好地分離，峰形良好，無血漿內(nèi)源性物質(zhì)峰干擾。其保留時間分別為普伐他汀鈉1.0 min和瑞舒伐他汀1.3 min。

圖3 MRM模式下典型色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+普伐他汀鈉對照品+內(nèi)標；C.游離型血漿樣品；D.總藥物型血漿樣品；1.普伐他汀鈉；2.瑞舒伐他汀Fig 3 The typical chromatograms in MRM modeA.blank plasma；B.blank plasma+pravastatin sodium control+internal standard；C.free type plasma sample；D.whole type plasma sample；1.pravastatin sodium；2.rosuvastatin

2.4.3 方法精密度:分別取空白血漿250 μl，加入高、中、低3個質(zhì)量濃度的QC樣本溶液50 μl，按“2.3”項下A部分和B部分方法分別處理。同一質(zhì)量濃度樣品于同一天連續(xù)進樣6次，進行日內(nèi)精密度分析；同一質(zhì)量濃度樣品于連續(xù)3 d進樣，進行日間精密度分析。其所得RSD值的范圍為5.0%～13.4%，說明方法精密度良好，結(jié)果見表1。

表1 精密度及回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.4.4 方法回收率:分別取空白血漿250 μl，加入高、中、低3個質(zhì)量濃度的QC樣本溶液50 μl，按“2.3”項下A部分和B部分方法分別處理，記錄峰面積，計算濃度。與相對應(yīng)的QC樣本溶液進行比較，得方法的平均加樣回收率，A部分方法處理:95.2%、87.2%和90.4%，B部分方法處理:87.5%、88.2%和90.7%，詳見表1。

2.4.5 絕對回收率和基質(zhì)效應(yīng):分別取空白血漿250 μl，加入高、中、低3個質(zhì)量濃度的QC樣本溶液50 μl，分別按“2.3”項下A部分和B部分方法分別處理，進樣分析，記錄峰面積。與上述QC樣本溶液直接進樣分析所得峰面積進行比較，其所得絕對回收率為（99.4±1.7）%、（99.6±1.6）%、（98.1±2.7）%（A部分方法處理）和（97.1±1.9）%、（98.4±2.2）%、（99.1±2.6）%（B部分方法處理）。QC樣本溶液直接進樣分析所得峰面積計算所得濃度與QC樣本溶液實際濃度比較即為基質(zhì)效應(yīng)，其RSD值分別為13.2%、10.1%、7.8%（A部分方法處理），5.2%、8.5%、6.1%（B部分方法處理），符合藥物體內(nèi)分析方法的規(guī)定。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗:分別取空白血漿250 μl，加入高、中、低3個質(zhì)量濃度的QC樣本溶液50 μl，按“2.3”項下A部分和B部分方法分別處理，分別于室溫放置8 h，－20℃放置2周及2個凍融循環(huán)，檢測放置前后濃度變化。結(jié)果，在3種貯存條件下，各濃度樣品未見明顯的變化。濃度前后變化的偏差小于±15%。說明樣品在正常貯存條件下是穩(wěn)定的。

2.5 蛋白結(jié)合率

6名健康成人志愿者空腹口服給藥（20 mg）后按上述時間間隔抽取靜脈血，按“2.3”項下A部分和B部分方法分別處理，并進樣分析。普伐他汀鈉蛋白結(jié)合率＝（總的普伐他汀鈉血漿濃度－游離型普伐他汀鈉血漿濃度）/總的普伐他汀鈉血漿濃度。1、2、4、6h時結(jié)果分別（50.5±5.7）%、（51.2±3.5）%、（49.8±6.8）%、（52.4±10.1）%。

3 討論

藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥物與血漿蛋白結(jié)合的量占藥物總濃度的百分率，是藥動學的重要參數(shù)之一。它影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝與排泄，從而影響其作用強度和時間，并往往與藥物的相互作用及作用機制等密切相關(guān)。因此，藥物血漿蛋白結(jié)合率的研究無論對于新藥研究開發(fā)還是指導臨床合理用藥都具有重要意義。本試驗利用超濾方法處理樣品配合靈敏的LC-MS/MS法檢測而得游離型普伐他汀血漿濃度，并與溶劑法處理所得總的藥物濃度相比較。所得結(jié)果可以看出不同時間普伐他汀血漿蛋白結(jié)合率約50%左右，保持一種較穩(wěn)定的狀態(tài)，其原因可能是隨著藥物被機體不斷代謝，與血漿蛋白結(jié)合的藥物又不斷游離出來，從而使游離型和結(jié)合型的藥物比例保持相對不變。普伐他汀的血漿清除半衰期約為1.5～2 h左右，由于普伐他汀被機體代謝的原因，志愿者一次性口服給藥后12 h和24 h的時間點未能檢出普伐他汀，因此，無法計算這2個時間點的血漿蛋白結(jié)合率。

超濾是一種篩孔分離過程，主要用來截留分子質(zhì)量高于500的物質(zhì)。通過高速離心所施加的壓力讓游離的藥物濾過，而大分子的蛋白和藥物和蛋白結(jié)合物也被除去。其本身有去除蛋白的作用。但超濾法的使用時因、壓力問題而造成部分結(jié)合型藥物又游離出來，從而對結(jié)果產(chǎn)生一定影響。

本文應(yīng)用超濾和溶劑法處理血漿樣品配合LC-MS/MS檢測技術(shù)，建立了一種專屬性強、準確度高、簡單快速的普伐他汀鈉的臨床血藥濃度檢測方法，通過檢測游離型的藥物濃度和血中總的藥物濃度，可用于測定其在健康志愿者血中的蛋白結(jié)合率。

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