硫辛酸對多柔比星致大鼠心肌細胞損傷凋亡的保護作用研究

張志剛，陳建忠，歐揚，劉平（.聊城市人民醫院藥學部，山東 聊城 5000；.山東大學齊魯醫院藥學部，濟南 50000）

多柔比星（Doxorubicin）是腫瘤化療中常用的一種廣譜有效的抗腫瘤藥物，但其嚴重的心臟毒性效應，使其臨床應用受到限制。尋找對多柔比星所致心肌損傷具有保護作用、又不影響多柔比星抗腫瘤作用的藥物實為必要。有證據[1]證明，多柔比星所致心臟毒性中，氧化應激和細胞凋亡發揮著極其重要的作用。有文獻[2]報道，硫辛酸（Lipoic acid，LA）可以對抗缺血再灌注腦神經元凋亡，但是硫辛酸對多柔比星所致心肌損傷凋亡的保護作用機制，目前文獻報道不多。本研究應用不同劑量硫辛酸對多柔比星所致大鼠心肌細胞凋亡相關基因抑制細胞凋亡因子Bcl-2、凋亡基因Bax蛋白表達的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

TDK-4離心機（上海安亭科學儀器制造廠）；JEM-1200EX透射電子顯微鏡（日本電子公司）；垂直電泳儀和轉膜槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

硫辛酸（注射液，山西亞寶藥業有限公司，批號:H20055869，規格:每支150 mg）；鹽酸多柔比星（注射用，浙江海正藥業股份有限公司，批號:030702，規格:每瓶10 mg）；原位缺口末端標記（TUNEL）試劑盒，Bcl-2、Bax多克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗均由武漢博士德公司提供。

1.3 動物

SD大鼠，清潔級，♂，體質量250～280 g，由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證號:SCXK（京）2006-0009。大鼠實驗前適應性喂養14 d。

2 方法

2.1 分組與給藥

將大鼠隨機分為正常對照組、模型組和低、中、高劑量[10、20、40 mg/（kg·d）][3]硫辛酸組，每組10只。后4組腹腔注射多柔比星3 mg/kg[4]，隔日1次，連用6次建模。硫辛酸組于注射多柔比星第2天起腹腔注射相應劑量的硫辛酸，每日1次，連用10 d。正常對照組腹腔注射生理鹽水10 mg/kg，隔日1次，共6次。

2.2 心肌細胞病理形態學觀察

多柔比星末次給藥24 h后處死大鼠，取出心臟，取心尖部米粒大小心臟，2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，丙酮脫水，環氧樹脂包埋，聚合，修塊，制成超薄組織切片，鉛鈾電子染色，透射電鏡觀察心肌細胞超微結構。

2.3 心肌細胞凋亡的檢測

每組隨機選取5個心肌標本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片后，每個蠟塊連續2張切片，切片經脫蠟后按照TUNEL試劑盒說明書操作，以細胞核呈棕褐色表示心肌細胞凋亡陽性。將切片于光鏡下放大400倍，每張切片隨機選取5個視野，分別計數細胞核總數和凋亡細胞核數，計算凋亡指數（AI，%）＝凋亡陽性細胞核數/細胞核總數×100%。

2.4 蛋白質印跡（Western blot）法檢測心肌細胞Bax、Bcl-2蛋白表達

取待測心肌，冰預冷PBS洗滌至緩沖液清澈，加入冰預冷的組織裂解緩沖液，4℃超聲粉碎，12000 r/min離心30 min，吸取上清，分裝，－70℃保存。用Lowry法[5]測定蛋白質含量。以牛血清白蛋白（BSA）為標準品，將各組蛋白濃度調成一致。用12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）法分離蛋白質，每個泳道蛋白上樣量為50 μg，電泳后轉硝酸纖維素膜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（TBS）沖洗，封閉，TTBS（加入吐溫20的TBS）沖洗。將膜放入Bcl-2、Bax多克隆抗體（1∶500稀釋），4℃過夜，TTBS沖洗后，將膜放入用HRP標記的羊抗兔二抗（1∶500稀釋）中，室溫孵育1～2 h，然后用TTBS洗膜3次，每次10 min。四唑氮藍/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸（NBT/BCIP）顯色液中避光顯色，顯色后終止反應。將蛋白質印跡顯影圖掃描，利用凝膠自動分析成像軟件Chem Image 5500對蛋白帶進行灰度值（A）分析。以β-肌動蛋白（β-actin）為內參蛋白，用目標蛋白表達量的灰度值與β-actin的灰度值比值表示目標蛋白的相對表達量。

2.5 數據統計

3 結果

3.1 心肌細胞超微結構變化

正常對照組大鼠心肌細胞肌絲排列整齊，肌節明暗帶清晰，線粒體飽滿，嵴致密排列規則。與正常對照組比較，模型組大鼠心肌細胞肌絲排列疏松、紊亂，大部分肌絲呈斷裂溶解狀，線粒體排列紊亂、腫脹、大小不等，嵴變短變少甚至消失，大部分線粒體形成空泡。低劑量硫辛酸組大鼠心肌細胞部分肌絲溶解，線粒體排列紊亂，線粒體峭不清晰，局部線粒體空化，有空泡形成。高劑量硫辛酸組大鼠心肌細胞可見肌絲排列整齊，少數肌絲溶解，肌節明暗帶清晰，線粒體有少數空化。除中劑量硫辛酸組外的其余各組大鼠心肌細胞的超微結構電鏡圖見圖1。

圖1 各組大鼠心肌細胞的超微結構電鏡圖（×15000）A.正常對照組；B.模型組；C.低劑量硫辛酸組；D.高劑量硫辛酸組Fig 1 Ultrastructural electron microscope of myocardial cell of rats in each group（×15000）A.normal control group；B.model group；C.LA low-dose group；D.LA high-dose group

3.2 心肌細胞凋亡指數變化

與正常對照組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡指數明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，低、中、高劑量硫辛酸組大鼠心肌細胞凋亡指數明顯降低（P＜0.01）。各組大鼠心肌細胞凋亡指數見表1。

表1 各組大鼠心肌細胞凋亡指數和Bcl-2、Bax蛋白表達比較（，n＝10）Tab 1 Comparison of apoptosis index of myocardial cell and protein expression of Bcl-2 and Bax of rats in each group（，n＝10）

表1 各組大鼠心肌細胞凋亡指數和Bcl-2、Bax蛋白表達比較（，n＝10）Tab 1 Comparison of apoptosis index of myocardial cell and protein expression of Bcl-2 and Bax of rats in each group（，n＝10）

與正常對照組比較:＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.01；與低劑量硫辛酸組比較:▲P＜0.01；與中劑量硫辛酸組比較:◆P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.01；vs.LAlow-dose group:▲P＜0.01；vs.LAmedium-dose group:◆P＜0.01

分組正常對照組模型組低劑量硫辛酸組中劑量硫辛酸組高劑量硫辛酸組ABax/Aβ-actin 0.77±0.031.40±0.03＊1.13±0.08#0.98±0.06#▲0.83±0.04#◆AI，%4.77±0.9333.40±1.23＊24.13±2.08#17.98±1.66#▲6.54±1.03#◆ABcl-2/Aβ-actin 1.50±0.100.41±0.05＊0.81±0.06#1.04±0.05#▲1.36±0.03#◆

3.3 心肌細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的變化

與正常對照組比較，模型組大鼠心肌細胞的Bcl-2蛋白表達明顯減弱，Bax蛋白表達明顯增強（P＜0.01）。與模型組比較，低、中、高劑量硫辛酸組大鼠心肌細胞的Bcl-2蛋白表達明顯增強，Bax蛋白表達明顯減弱（P＜0.01），且呈劑量依賴性。各組大鼠心肌細胞Bcl-2、Bax蛋白表達見表1，電泳圖見圖2。

圖2 各組大鼠心肌細胞Bcl-2、Bax蛋白表達電泳圖1.正常對照組；2.模型組；3.低劑量硫辛酸組；4.中劑量硫辛酸組；5.高劑量硫辛酸組Fig 2 Electrophoretogram of protein expression of Bcl-2 and Bax in myocardial cell of rats in each group1.normal control group；2.model group；3.LA low-dose group；4.LA medium-dose group；5.LAhigh-dose group

4 討論

硫辛酸是一種很強的抗氧化、抗自由基的化合物，其在體內吸收進入細胞后，可還原成二氫硫辛酸并釋放到細胞外，還可以進入細胞的脂相與水相部分，在任何部位清除自由基，發揮“全能抗氧化劑”的作用。有研究[6]表明，LA通過上調Bcl-2蛋白表達，減少活性氧的產生，從而抑制大鼠腦細胞的凋亡。硫辛酸可以拮抗環磷酰胺所致大鼠心肌線粒體酶和線粒體外膜的改變[7]。但是，硫辛酸對多柔比星所致大鼠心肌毒性有無保護作用，國內外鮮見文獻報道。

在本研究中，筆者建立了多柔比星致心肌細胞損傷模型。電鏡下可見模型組大鼠心肌細胞肌絲斷裂溶解，線粒體彌散腫脹，嵴排列紊亂，局部或整個線粒體斷裂溶解和空泡化，顯示作為心肌能量的細胞器線粒體功能不良，藥品的不良反應對心肌細胞造成了損傷。已有研究[1]證實，在多柔比星所致心肌損傷過程中，細胞凋亡發揮著極其重要的作用，心肌細胞暴露在多柔比星中會發生細胞凋亡，而過度的細胞凋亡會引起心功能損害。細胞凋亡在個體正常發育成熟、維持機體內環境穩定以及多種疾病的發生、發展的病理生理過程中具有很重要的生物學意義。凋亡加速基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2被認為與氧化應激和細胞凋亡關系密切[8]。Wu S等[9]用多柔比星處理培養的乳鼠心肌細胞和臍靜脈內皮細胞，結果發現，細胞內Bcl-2表達下降，且與多柔比星的劑量相關。促進凋亡的Bax能與Bcl-2形成異源二聚體并通過抑制后者活性促進凋亡發生。多柔比星通過上調Bax，使線粒體膜間腔的細胞色素C釋放入胞漿，啟動凋亡程序。本實驗中，用Western blot法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達水平，結果顯示硫辛酸保護心肌細胞的作用機制可能與增強心肌細胞Bcl-2蛋白表達和抑制Bax蛋白表達有關。

[1]孫習鵬，萬麗麗，郭澄.多柔比星心臟毒性機制研究進展[J].中國藥房，2010，21（9）:853.

[2]尹志奎，鄭斌，崔旭，等.α-硫辛酸對缺血再灌注腦神經元凋亡的作用[J].山東醫藥，2005，45（23）:18.

[3]Mythili Y，Sudharsan PT，Selvakumar E，et al.Protective effect of DL-α-lipoic acid on cyclophosphamide induced oxidative cardiac injury[J].Chem Biol Interact，2004，151（1）:13.

[4]賴平，馬郁文，杜軍保，等.1，6二磷酸果糖對大鼠阿霉素心肌病的防治作用及機理的探討[J].中華兒科雜志，1997，35（7）:368.

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[6]Antonio AM，Gillespie RA，Druse-Manteuffel MJ.Effects of lipoic acid on antiapoptotic genes in control and ethanol-treated fetal rhombencephalic neurons[J].Brain Res，2011（1383）:13.

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[9]Wu S，Ko YS，Teng MS，et al.Adriamycin-induced cardiomyocyte and endothelial cell apoptosis:in vitro and in vivo studies[J].J Mol Cell Cardiol，2002，34（12）:1595.