經選擇的肺腺癌患者中EML4-ALK融合基因發生率的研究

孟麗娟 王峻 樊衛飛 蒲驍麟 王琳 劉福銀 楊民

EML4-ALK融合基因是非小細胞肺癌(NSCLC)中最新發現的一種癌基因，該融合基因的發現及相關研究是2009年NSCLC的10大事件之一。EML4-ALK融合基因可導致腫瘤基因ALK結構激活，現已是新的NSCLC診斷標志和治療靶標。本文比較了不吸煙或少吸煙的EGFR野生型和EGFR狀態未明2組肺腺癌患者中EML4-ALK融合基因檢測的陽性率，以探討結合臨床特征和分子事件篩選檢測人群的可行性，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑 DNA提取試劑盒(天根生物有限公司)，TaqDNA聚合酶、PCR引物、PCR產物純化回收試劑盒(上海生物工程有限公司);ALK基因斷裂重組試劑盒(北京金菩嘉有限公司)。

1.2 研究對象 選擇2010年1月至2012年10月在我院住院及門診就診的新診斷的肺腺癌患者。入組對象需同時符合以下2點:(1)經病理確診為NSCLC;(2)不吸煙或少吸煙者。共100例，男56例，女44例，年齡34～72歲，平均(57.1±3.1)歲。根據EGFR狀態分為EGFR野生型組和EGFR狀態未知組。EGFR野生型組50例，其中男29例(58%)，女21例(42%);年齡34～72歲，平均(57.3±3.4)歲，＜60歲者28例(56%)，≥60歲者22例(44%);臨床分期Ⅰ期5例(10%)，Ⅱ期18例(36%)，Ⅲ期27例(54%)。EGFR狀態未知組50例，其中男27例(54%)，女23例(46%);年齡35～70歲，平均(56.5±2.7)歲，＜60歲者29例(58%)，≥60歲者21例(42%);臨床分期Ⅰ期 4例(8%)，Ⅱ期 17例(34%)，Ⅲ期 29例(58%)。2組在性別、年齡及疾病分期方面差異無統計學意義，具有可比性。

1.3 實驗方法

1.3.1 直接測序檢測EGFR突變

1.3.1.1 石蠟標本DNA提取:(1)石蠟標本按10～15 μm切片。切片刮取包埋組織若干，置1.5 ml EP管，加二甲苯1200 μl震蕩混勻，55～60℃溫育2～3 h進行脫蠟處理;(2)8000 r/min離心10 min，去除二甲苯;(3)加 無 水 乙 醇 1200μl，震 蕩 混 勻，10 000 r/min離心5 min后吸棄乙醇。(4)37℃烤箱干燥30 min，55℃過夜消化后按基因組DNA抽提試劑盒說明書進行操作。

1.3.1.2 引物設計及合成:EGFR 18～21號外顯子引物序列見下表，所有引物序列均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，詳見表1。

表1 EGFR外顯子引物序列

1.3.1.3 巢氏PCR擴增:石蠟標本提取全基因組DNA應用巢氏PCR進行2輪擴增。巢氏PCR第1輪擴增體系:PCR反應體系總體積為25 μl，包括:基因組DNA 2 μl，Mix 12.5 μl，Primer 1F 1 μl，Primer 1R 1 μl，ddH2O 8.5 μl。巢氏PCR第2輪擴增體系:第1輪擴增產物 2 μl，Mix 12.5 μl，Primer 2F 1 μl，Primer 2R 1 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR 擴增反應條件:EGFR 基因第1輪擴增反應條件:初始變性(95℃，5 min);30個循環:變性(94℃，30 s)，退火(60 ℃，30 s)，延伸(72℃，1 min);最終延伸(72℃，10 min)。EGFR基因第2輪擴增反應條件:初始變性(95℃，5 min);35個循環:變性(94℃，30 s)，退火(60℃，30 s)，延伸(72℃，1 min);最終延伸(72℃，10 min)。

1.3.1.4 PCR擴增產物DNA測序及突變解讀:PCR擴增產物經凝膠電泳證實后，由上海生工生物工程技術服務有限公司完成DNA測序。運用CIIROMAS軟件解讀基因測序圖形。運用The Basic Local AI ignment Search Tool(BLAST)將DNA序列與標準野生型DNA序列進行比較，找出變異位點，若在所檢測的核苷酸的相對應位點發現有變異，則可能為基因突變。突變的最終確定需要肉眼對DNA圖形進行確認。

1.3.2 FISH法檢測EML4-ALK融合基因

1.3.2.1 操作步驟:石蠟標本按4 μm切片。按下述步驟操作:(1)56℃，烤片3～5 min;(2)室溫，松節油10 min 2次;(3)室溫，100%乙醇5 min;(4)室溫，100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各2 min;(5)室溫，去離子水3 min，用無線紙巾吸取多余的水分;(6)50℃，酸性亞硫酸鈉30 min;(7)37℃，蛋白酶K 10～30 min［取0.4 ml蛋白酶K儲存液(20 mg/ml)溶于40 ml 2×SSC(pH 7.0)得到蛋白酶 K工作液(200 μg/ml)］;(8)室溫，2×SSC 5 min 2次;(9)室溫，70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇各3 min;(10)自然干燥玻片;(11)56℃，烤片2～5 min;(12)探針準備:雜交液8 μl和探針 2 μl加入到 0.5 ml離心管中混勻，離心1～3 s，備用。(13)將10 μl探針混合物滴加于玻片雜交區域，立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠封邊;(14)準備雜交儀器，共變性條件，83℃ 7 min，雜交條件，42℃ 16 h;(15)46℃，2×SSC 5 min;(16)46℃，0.1%NP-40/2×SSC 5 min;(17)室溫，70%乙醇3 min后于暗處自然風干玻片;(18)室溫，將15μl DAPI復染劑滴加于玻片雜交區域，立即蓋上蓋玻片，15 min后觀察。

1.3.2.2 FISH結果判斷標準:綠色探針示ALK基因5'端，紅色探針示ALK基因3'端。兩者融合為黃色，表示ALK基因未發生重排，即無EML4-ALK融合基因;兩者分離表示ALK基因發生重排，即存在EML4-ALK融合基因。計數100個細胞，其中異常細胞≥20%為陽性，＜20%則為陰性。

1.4 統計學分析 應用統計軟件SPSS 20.0進行數據處理。率的比較采用卡方檢驗，雙側檢驗P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EML4-ALK融合基因發生率 EGFR野生型組有15例EML4-ALK融合基因陽性(15/50，30%);EGFR狀態未知組有4例EML4-ALK融合基因陽性(4/50，8%)，2組比較有顯著性差異(P＜0.05)。FISH陰性結果見圖1，陽性結果見圖2。

2.2 EML4-ALK融合基因陽性患者臨床特征 100例患者中，EML4-ALK融合基因發生率與年齡、性別、腫瘤分期無明顯相關性(P＞0.05)，見表2。

3 討論

全球肺癌每年平均新發病例數超過160萬，其中85%為NSCLC，＞50%的NSCLC患者在初診時已是晚期［1］。在肺癌發病率迅速增長的同時，肺癌的構成比例也發生著重要變化，鱗癌比例下降，腺癌比例上升，已成為NSCLC中最常見的病理類型。2011年，國際肺癌研究協會(IASLC)、美國胸科學會(ATS)及歐洲呼吸學會(ERS)聯合頒布了肺腺癌的國際多學科分類新標準。新標準要求進一步細化診斷，重視重要分子事件如EGFR突變、K-RAS突變、EML4-ALK融合基因等。次年，《2012非小細胞肺癌NCCN指南》作出了重要修訂，明確了FISH為EML4-ALK融合基因檢測的金標準。不同的分子事件需要不同的治療方法，比如:EGFR突變、K-RAS野生型的患者首選表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)［2］;EML4-ALK融合基因陽性的患者則不能從EGFR-TKI治療中獲益，目前針對EML4-ALK融合基因的靶向藥物正在臨床研究中。

2007年日本學者Soda等［3］首次在NSCLC患者術后標本中檢測到EML4-ALK融合基因。此后，美國、日本、韓國及中國香港均有報道［4-6］。檢測EML4-ALK融合基因有切實的臨床意義。最近一項開放、多中心參與的Ⅱ期臨床試驗中，82例EML4-ALK融合基因陽性NSCLC患者口服crizotinib(ALK及c-Met基因的共同抑制劑)后，總體有效率為57%(47/82)，8周疾病控制率為87%［7］。可見，針對 ALK的靶向治療成為治療EML4-ALK融合基因陽性患者的一種重要方法。

然而，EML4-ALK融合基因在NSCLC患者中陽性檢出率較低，僅約1.5% ～6.7%。Shaw等［8］為了提高該融合基因的檢出率，設定入組患者必須具備2種或更多的下列臨床特征:女性、亞裔、無或僅少量吸煙史、腺癌。結果顯示該融合基因的陽性率可提高到13%(19/141)，如果不吸煙或僅少量吸煙者和(或)不伴有EGFR突變者，其陽性率分別高達22%和33%。Sasaki等［6］統計了8個包括亞洲人、歐洲人的大樣本臨床研究，共1276例，不吸煙或輕度吸煙的NSCLC患者中EMIA-ALK表達陽性率為9.4%，而在吸煙的NSCLC患者中，陽性率只有2.9%。EGFR和KRAS基因均為野生型的高加索肺腺癌患者中ALK融合基因陽性率(FISH法)高達30%以上，而EGFR和KRAS基因均為野生型的中國肺腺癌患者中ALK融合基因陽性率(RACE——coupled PCR 法)卻達到了 42.8%［6］。這提示我們，經篩選的病例可顯著提高EML4-ALK融合基因的陽性率。本研究顯示經病理確診的不吸煙或少吸煙的肺腺癌患者，EGFR野生型組EML4-ALK融合基因陽性率達30%，而EGFR狀態未明組EML4-ALK融合基因陽性僅8%，2組差異有顯著性。EML4-ALK融合基因發生率與年齡、性別、臨床分期無明顯相關性。陽性率小于國內報道值(40%)，可能與篩選方案不同及檢測方法不同有關。Zhang等［9］的研究同時檢測了EGFR和K-RAS狀態，要求兩者均為野生型，EML4-ALK融合基因采用的是RACE——coupled PCR法;本研究僅要求EGFR為野生型，同時采用的FISH法檢測EML4-ALK融合基因。本研究顯示在不吸煙或少吸煙的肺腺癌患者中，經EGFR基因狀態篩選可提高ML4-ALK融合基因檢測陽性率。由于本研究樣本量偏小，結果仍有待大規模的研究進一步佐證。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer Statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2012，62(1):10-29.

［2］劉福銀，王峻，樊衛飛，等.吉非替尼治療老年晚期非小細胞肺癌的臨床研究［J］.實用老年醫學，2009，23(5)370-372.

［3］Soda M，Choi YL，Enomoto M，et al.Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer［J］.Nature，2007，448(7153):561-566.

［4］Wong DW，Leung EL，So KK，et al.The EML4-ALK fusion gene is involved in various histologic types of lung cancers from nonsmokers with wild-type EGFR and KRAS ［J］.Cancer，2009，115(8):1723-1733.

［5］Choi YL，Takeuchi K，Soda M，et al.Identification of novel isoforms of the EML4-ALK transforming gene in non-small cell lungcancer ［J］.CancerRes，2008，68(13):4971-4976.

［6］Sasaki T，Rodig SJ，Chirieac LR，et al.The biology and treatment of EML4-ALK non-small cell lung cancer［J］.Eur J Cancer，2010，46(10):1773-1780.

［7］Kwak EL，Bang YJ，Camidge DR，et al.Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer［J］.N Engl J Med，2010，363(18):1693-1703.

［8］Shaw AT，Yeap BY，Mino-Kenudson M，et al.Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK［J］.J Clin Oncol，2009，27(26):4247-4253.

［9］Zhang X，Zhang S，Yang X，et al.Fusion of EML4 and ALK is associated with development of lung adenocarcinomas lacking EGFR and KRAS mutations and is correlated with ALK expression［J］.Mol Cancer，2010，9(9):188-199.