SYBR GreenⅠ染料法定量PCR檢測瘧原蟲感染及鑒別蟲種的臨床應用

陳江濤 劉配芬 鐘德善 潘雪峰 楊輝 楊立業 陸志為 楊惠鈿 林敏★

Santiago-m Monte-Nguba6 Juan Carlos Salas Ehapo6 Urbano Monsuy Eyi6

瘧疾是嚴重危害人類健康和生命安全的疾病，同結核病、艾滋病一起被WHO列為當前危害最為嚴重的三大傳染病。目前，全球仍有近100個國家和地區流行瘧疾，全球約40%人口受到感染威脅，每年有2億多人感染瘧疾，約65.5萬人死于瘧疾[1,2]。寄生人體的瘧原蟲有4種，即間日瘧原蟲（Plasmodium vivax）、三日瘧原蟲（Plasmodium malariae）、卵形瘧原蟲（Plasmodium ovale）和惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum），其中惡性瘧原蟲致病性最強，死亡率最高，是目前地球上對人類危害最嚴重的蚊媒寄生原蟲病。瘧疾流行最嚴重的地區為非洲撒哈拉沙漠以南，拉丁美洲和東南亞地區，其中，約85%的瘧疾發病和91%的死亡病例出現在非洲，因此瘧疾在非洲許多國家被稱為“頭號殺手”[2]。隨著我國經濟發展，國力增強，我國援非項目以及國際交往增多，許多到非洲工作的人員感染瘧疾的機會變得越來越高[3]。

瘧疾的快速診斷和早期治療是其防治的關鍵，但目前對于瘧疾診斷的手段較為落后，多采用膠體金檢測瘧原蟲抗原或者顯微鏡鏡檢，敏感性較低，容易在瘧原蟲密度低的時候漏檢[4]；也有少數采用巢式PCR或TaqMan探針法對瘧原蟲進行檢測，但是存在著操作復雜繁瑣或者只能對單一蟲種進行檢測的缺點[5,6]。我們利用一種基于四種瘧原蟲的小亞基單位核糖體核酸（18S rRNA）共同特征序列為基礎設計的可對瘧原蟲進行定量且做蟲種鑒別的實時熒光定量PCR的方法，對非洲赤道幾內亞援外醫療隊門診的華人患者進行鑒別診斷。

1 材料與方法

1.1 標本來源

150份血樣本采自非洲中國援赤道幾內亞醫療隊馬拉博保健門診，均為我駐赤道幾內亞中資公司的華人，采集疑似患者標本外周血20 μL，滴在903標本采集濾紙上（Whatman-新華公司）干燥后4℃保存備用。同時做血涂片進行吉姆沙染色進行顯微鏡鏡檢[8]。陽性質控為以往門診采集的惡性瘧原蟲鏡檢強陽性樣本。陰性質控為惠州市中心人民醫院常規體檢樣本20例，且涂片經鏡檢瘧原蟲陰性。

1.2 儀器及耗材

LightCycle 480II熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司），MJ mimi型梯度PCR擴增儀（美國Bio-Rad），微量加樣器（德國Eppendorf公司），超凈工作臺（中國蘇州精華設備有限公司），干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司），TGL-20B型和TGL-28C-C型臺式高速離心機（上海安亭科學儀器廠），LightCycle 480II熒光定量PCR儀專用96孔PCR板及封板膜（荷蘭Bioplastics公司）。

1.3 瘧原蟲基因組DNA（gDNA）提取

利用自配10%的Chelex-100提取瘧原蟲基因組DNA，首先剪切0.5×0.5 cm濾紙血斑，加500 μL去離子蒸餾水，震蕩30 s，然后靜置半小時以上。接著震蕩后用13 600 rpm離心4 min，棄上清。加160 μL的10%濃度的Chelex-100，振蕩后用56℃孵育2 h，接著98℃變性 8 min，振蕩 30 s，13 500 rpm 離心 1 min，然后放置于冰箱4℃冷卻半小時以上，備用。

1.4 定量PCR及熔解曲線鑒定蟲種

采用以往文獻報道的引物[7]：上游引物18S-qF：5'-ATAACGAACGAGATCTTAACCT-3'；下 游 引 物為 18S-qR：5'-ATCGTTCCTCTAAGAAGCTTTA-3'。引物由上海英俊生物技術（廣州）公司合成。反應體系總體積20 μL，包括0.2 μL的HotStat DNA聚合酶（大連寶生物工程公司），4 μL的5×PCR buffer（Mg2+plus），1.6 μL 的脫氧核苷三磷酸（dNTP，10 mmol/μL），上述引物各 1 μL（5 μmol/μL），9.2 μL 的雙蒸滅菌水，1 μL的SYBR Green I染料（20×，廣州東盛生物科技有限公司）和2 μL的上述模板DNA。PCR擴增及熔解曲線分析均在LightCycle 480II 熒光定量PCR儀上進行。PCR擴增參數如下：預變性95℃ 3 min；擴增98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 20 s，共 36 個循環。熔解曲線鑒定程序如下：95℃ 1 min，40℃ 1 min，熔解曲線數據收集從60℃至95℃，溫度上升為1℃/s,且每升高1℃進行5次的數據采集，最終采用儀器軟件對Tm值進行分析。

四種瘧原蟲（間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和惡性瘧原蟲）的標準質粒由江蘇省寄生蟲研究所的曹俊教授構建并贈送給本實驗室，該質粒將四種瘧原蟲的18S rRNA的序列特征的PCR 產物用TA克隆法連接到以pGEM-T載體上。質粒濃度為107copy/mL。我們將該質粒進行梯度稀釋（1×107copy/mL，1×106copy/mL，1×105copy/mL，1×104copy/mL）繪制標準曲線，對標本進行定量分析。進行熔解程序后將每例樣本的Tm值與標準質粒做對比，可以確定瘧原蟲的蟲種類型。

1.5 定量準確性，敏感度評價

我們按照雙盲法，與上海之江生物生產的瘧原蟲通用試劑盒進行定量準確性的比對，該試劑盒采用PCR結合TaqMan探針技術，引物及探針參照以往文獻[9～10]。將傳統鏡檢法與我們的方法進行檢出率的比對。將惡性瘧原蟲質粒按10倍梯度稀釋，稀釋后溶液分別作為模板，進行熒光定量PCR擴增，確定熒光定量PCR的檢測下限，進行靈敏度的評價，稀釋后質粒的拷貝數數值如下1×102copy/mL, 5×102copy/mL,1×103copy/mL, 5×103copy/mL, 1×104copy/mL,5×104copy/mL。

1.6 準確性評價

采用Primer premer 5.0軟件針對瘧原蟲的18S rRNA基因設計出四種瘧原蟲的通用引物如下：rPLU1F: 5'-TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA-3'；rPLU5R: 5'-CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC-3'。按照反應體系總體積50 μL，包括1 μL的DNA聚合酶（廣州東盛生物科技有限公司），5 μL的10×PCR buffer（Mg2+plus），4 μL 的脫氧核苷三磷酸（dNTP，10 mmol/μL），上述引物各 1 μL（20 μmol/μL），36 μL 的雙蒸滅菌水，2 μL的上述模板DNA。PCR擴增在MJ mimi型梯度PCR擴增儀上進行。PCR擴增參數如下：預變性95℃ 10 min；擴增 95℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，共40個循環；72℃延伸5 min。產物為1 600 bp，送上海英俊生物技術（廣州）公司測序部進行測序，然后將測序結果在NCBI與標準序列進行比對，進行蟲種鑒定，以此為金標準與我們的方法進行比較。

1.7 統計學分析

用SPSS16.0軟件對數據進行統計分析。采用卡方檢驗對不同方法學的檢出率進行比較，用成對t檢驗對檢測的拷貝數進行比較，若P＜0.05為兩者之間存在統計學差異。

2 結果

2.1 定量PCR檢測結果及準確性、敏感度評價

150份血樣中，我們的檢測方法與瘧原蟲商品PCR試劑盒均檢測出陽性樣本29例，檢出陽性率19.3%，兩者之間檢出率一致（P＞0.05）。對兩個方法學的標本拷貝檢測數進行t檢驗，兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）。兩個方法的20例陰性對照組檢測結果一致，均為陰性。然而我們發現與定量PCR法不同，對150份樣本的鏡檢僅發現27例陽性結果，陽性率為18%，陽性樣本鏡檢結果見圖1。我們對另外2例定量PCR與鏡檢法存在差異的樣本進行分析并對血涂片進行擴大觀察范圍復檢，發現此2例樣本的拷貝數均在5×102～1×103copy/mL之間，蟲量較少，在擴大觀察范圍后發現蟲體。標準質粒確認該方法的敏感度為最低檢測下限為1×102copy/mL至5×102copy/mL之間。

圖 1 血涂片中的惡性虐原蟲鏡檢結果（10×100）Figure 1 The results of Plasmodium falciparum in blood smear under microscope(10×100)

2.2 蟲種鑒別準確性評價

對四種人體瘧原蟲定量PCR擴增產物的Tm值進行分析的結果如圖2-A所示，四條熔解曲線均為單一的峰，這說明反應中無產生非特異性產物及引物二聚體。四種人體瘧原蟲擴增產物的Tm值分別為：惡性瘧原蟲76.5℃（圖2-A-a），三日瘧原蟲78.5℃（圖2-A-b），卵形瘧原蟲 80.6℃（圖 2-A-c），間日瘧原蟲81.7℃（圖2-A-d），間隔明顯，容易區分不同的蟲種。在本次檢測中發現的29例陽性樣本，經鑒別均為惡性瘧原蟲。18S RNA基因擴增后電泳切膠回收，測序結果比對，百分之一百一致，產物電泳圖如圖2-B所示。

3 討論

瘧原蟲是嚴重危害人類健康的世界性疾病之一，80%的病例都發生在非洲。赤道幾內亞共和國（The Republic of Equatorial Guinea）位于非洲中西部，西臨大西洋，北鄰喀麥隆，東、南與加蓬接壤。海岸線長482公里。屬熱帶雨林氣候，年平均氣溫24℃～26℃。赤道幾內亞是全世界50個最不發達國家之一，由于熱帶雨林的氣候，國家的衛生、經濟條件差，瘧疾流行。該國從1970年與我國建交以來，我國長期派駐工程隊及醫療隊援助該國進行各項建設。由于我國的瘧疾流行基本消滅，對于瘧疾缺乏抵抗能力，因此我國的工人進駐當地更容易感染瘧疾而且癥狀更為嚴重。我們知道，瘧疾的早期快速診斷對瘧疾的治療是極其重要的，而當地采用的主要是顯微鏡厚薄血片染色鏡檢法，該方法費時費力，而且要求專門的鏡檢設備和技術熟練的鏡檢員，尤其在原蟲血癥較低的時候，敏感性差，容易造成漏診和誤診[4,7]。隨著與世界各國之間的交流加強，當地的衛生部門已經擁有各國捐獻的熒光定量PCR儀，因此我們考慮采用一種簡便，經濟，快速的診斷方法去進行瘧疾的快速定量及蟲種的鑒別。

圖 2 四種瘧原蟲熔解曲線及18S RNA基因PCR擴增結果Figure 2 Melting cures of four kinds of Plasmodium spp and PCR results of 18S RNA gene

從我們的實驗結果可知，這種診斷四種瘧原蟲18S RNA基因的SYBR Green I定量PCR法能夠同時對瘧原蟲進行定量及蟲種鑒別。在我們的結果中發現，拷貝數在102～103copy/mL之間的時候，其敏感性優于傳統的厚血膜鏡檢法，不容易漏檢。我們將其與我國臨床使用的瘧原蟲通用TaqMan法診斷試劑盒相比，對于這批樣本的檢出率無統計學差異（P＞0.05），且相對于 TaqMan法，SYBR Green I染料熒光定量PCR技術價格低廉[9,10]，更適合當地的實際情況。與傳統的巢式PCR方法相比較，這種方法無需對PCR產物進行凝膠電泳分析，可避免產物引起模板污染；而且采用實時觀察反應的方式判讀結果，可以在一定程度上避免了傳統PCR容易產生的假陽性結果。

從我們門診的數據顯示，我國工人在赤道幾內亞感染瘧原蟲的檢出率高達19.3%，這一方面提示我們的駐外工作人員在當地應該做好防蚊的防護工作，另外一方面也說明當地的瘧疾流行情況是非常嚴重的，需要世界衛生組織開展更多的支援工作區控制瘧疾的流行。因此，該方法不僅可以對瘧疾的早期快速診斷鑒別，而且可以用于抗瘧藥物療效的觀察與瘧疾疫苗使用效果進行評價。因此該方法在當地的使用及推廣，有利于赤道幾內亞的衛生部門對于瘧疾的防控及科研工作的開展。

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