TaqMan探針實時熒光PCR對馬鹿真偽鑒別方法的建立

王 準，王向輝，劉 博，李文君，劉金華*

1.長春海關技術中心，吉林長春 130000；2.長春國際旅行衛生保健中心，吉林長春 130000

1 引言

我國是世界上鹿類資源最豐富的國家之一，據初步統計現養鹿約50萬頭，全國養鹿場達到4000多家[1]。根據對鹿科動物進化的研究，梅花鹿、馬鹿、白鹿、白唇鹿、水鹿等均產自我國[2]。

鹿全身都是寶，民間稱鹿茸為“寶中之寶”。其中最具藥用價值的當屬梅花鹿和馬鹿。馬鹿鹿茸產量很高，是名貴中藥材。明朝名醫李時珍曾在《本草綱目》中以“生經補髓，養血益陽，強筋健骨”來形容鹿茸。它的鹿胎、鹿鞭、鹿尾和鹿筋也是名貴的滋補品。隨著人們生活水平的提高，鹿茸在食品、藥品以及保健品行業的地位也越來越受重視。由于馬鹿價格昂貴且與其偽制品在外觀上難以辨別，為降低成本，常有一些不法分子為了牟取暴利常常魚目混珠，坑騙消費者。為了獲得高昂的利潤而進行的造假、販假不僅使消費者在經濟上、精神上受到損害，而且也給構建和諧的市場秩序造成了嚴重危害。

目前國內外主要通過直觀性狀鑒定和常規理化鑒定，來分辨鹿產品的真偽，但是偽制品用這兩種方法極難準確鑒定[3]。建立一種快速有效的檢測方法即保護了市場秩序從而也使消費者的利益不受侵害。

目前，人們對于如豬、牛、羊、馬、雞、鴨等動物源性成分的檢測都進行了研究，但鮮有對馬鹿的快速、簡單、特異且靈敏地鑒別研究。其主要根據凝膠電泳的條帶片段大小來判斷是否含有鹿源性成分，該方法存在靈敏度低，操作復雜，耗時長，容易污染出現假陽性等特點。

因此，本領域需要一種快速、特異性好、靈敏度高的馬鹿的真偽鑒別方法，進行中藥材馬鹿茸真偽的鑒別。不同鹿科物種的線粒體控制區存在差異性，通過設計特異性寡核苷酸引物及探針來檢測。該方法操作簡便，并且在技術上不僅具有更強的特異性和更高的測量靈敏度，大大縮短了測量檢測時間，達到了穩定、可靠、周期短、成本低廉的效果，而且減少了在條件簡陋的基層檢測單位因檢測環境等因素帶來的污染可能。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

2.1.1 材料與試劑

鹿科物種：馬鹿肉、馬鹿茸、梅花鹿心、馴鹿角、白臀鹿肉；非鹿科屬：貉肉、羊肉、豬肉、牛肉、雞肉、馬肉、鵝肉、鴨肉等。以上動物材料均為實驗室自存；核酸提取試劑盒；TaqMan實時熒光 PCR 預混合液；引物、TaqMan探針。

2.1.2 儀器

HeraeusFresco21型冷凍離心機；Mili-Q純水器；innupure c16 touch核酸自動提取工作站；ABI Q7實時熒光定量PCR儀。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣本DNA的提取

用商品化試劑盒（smartDNAprep）提取鹿科屬和非鹿科屬的DNA模板。

2.2.2 引物和探針的設計

根據GenBank中馬鹿線粒體控制區基因序列，同時通過NCBI-BLAST進行同源性比對，選擇特異性的基因區間，利用Primer Express 3.0.1軟件，設計特異性引物、探針（見表1）。

表 1 馬鹿物種的特異性引物、探針

2.2.3 實時熒光PCR檢測方法的建立

實時熒光PCR反應體系組分為：TaqmanUniversalMasterMix（2×）12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L） 0.5 μL，TaqMan探針（10 μmol/L）0.5 μL，DNA模 板5 μL，加ddH2O至總體積為25 μL。

實時熒光擴增程序為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 預變性10 min ；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s， 45個循環；在退火延伸（60 ℃）時進行收集熒光信號。

2.2.4 特異性實驗

提取馬鹿肉、馬鹿茸DNA模板作為陽性對照、提取梅花鹿血、馴鹿角、白臀鹿肉、貉肉、羊肉、豬肉、牛肉、雞肉、馬肉、鵝肉、鴨肉等DNA模板作為陰性對照，并對其擴增，從而根據Ct值來驗證引物和探針的特異性。

2.2.5 敏感性實驗

將馬鹿DNA模板10倍稀釋為5個梯度：1.7、 0.17、0.017、0.0017、0.00017 ng/μL 作為模板，重復測定2次，確定最小檢測量。

3 結果與分析

3.1 特異性試驗結果

結果顯示，在FAM熒光通道下馬鹿肉和馬鹿茸的DNA模板為典型的S型擴增曲線，而陰性對照樣本均呈直線，即該方法能夠特異性的對馬鹿DNA進行檢測（圖1）。

圖1 實時熒光PCR特異性擴增曲線結果（圖1中，1為馬鹿肉，2為馬鹿茸）

3.2 敏感性驗證結果

將馬鹿DNA模板（1.7 ng/μL）10倍稀釋為5個梯度（1.7 ng/μL～0.00017 ng/μL），進行熒光PCR檢測。結果顯示，其檢測下限可達0.00174 ng/μL。

圖2 實時熒光PCR敏感性實驗結果（圖2中，1～5濃度分別為1.74、0.174、0.0174、0.00174、0.000174 ng/μL）

4 結論與討論

目前市場上的常見偽品：市面上售賣的鹿茸60%以上是以馴鹿制成的非藥典品[4]；用豬皮包裹面粉，豬血的混合物再切片用以仿制馬鹿茸；經過乙醇浸泡處理的真鹿茸，陰干過后的偽劣品充當真品售賣[5]，這種加工處理過后的鹿茸藥用價值基本損失；以動物的骨骼、皮毛和色素加工而成[6]。盡管這些偽充品沒有明顯的副作用，但不良商家的這些舉動嚴重的侵犯了消費者權益，對消費者身心造成了巨大傷害，影響了社會穩定。

隨著現代科學技術的發展，摻偽水平和手段越來越高明，關于鹿產品的真偽鑒別方法也不斷更新，從最早期的感官檢驗到后來通過色譜、光譜進行鑒別[7]，再到免疫學法[8]、基于Cytb基因鑒別法[9]、基于COⅠ序列鑒別法[10]等。但是由于多數檢測方法易受不同品種及產地的鹿產品中所含有的化學成分影響，摻偽成分越來越復雜，這些因素嚴重限制了傳統檢測方法的應用空間，局限性較大。而通過熒光基團的信號變化特異性的檢測到種的水品，縮短了檢測時間的同時也提高了檢測的準確性，為動物源性成分定性提供有效的技術保障[11～13]。TaqMan實時熒光PCR技術的應用，會促進PCR技術在中藥材、食品及醫療領域的發展，它保證了食品藥品安全，更是為市場監督管理提供技術依托的檢測機構提供了巨大的便利，同時對于打擊假冒偽劣鹿產品、保障消費者權益和維護市場秩序更具有深遠意義。