生長時期對4株綠藻脂肪含量和脂肪酸組成的影響

曹春暉，孫世春，麥康森，梁 英

(1. 中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，青島 266003；2. 天津科技大學(xué)天津市海洋資源與化學(xué)重點實驗室，天津 300457)

微藻具有生化合成高度不飽和脂肪酸(highly unsaturated fatty acids，HUFAs)的能力，因此被作為二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等(n-3)HUFAs的新來源而受到廣泛重視．微藻可作為浮游動物(輪蟲、枝角類等)、甲殼類、雙殼類和幼齡魚類的餌料而在海水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位．對許多海產(chǎn)動物來說，餌料中含有豐富的魚蝦類生長所必需的脂肪酸(essential fatty acids，EFA)尤其是 EPA 和DHA，能夠提高其生長率和幼體的存活率．HUFAs對人體也有非常重要的生理作用，可防治多種心血管疾病，促進(jìn)兒童智力及心理發(fā)育．

微藻的脂肪含量以及脂肪酸構(gòu)成的數(shù)量和質(zhì)量都可因環(huán)境因子而改變[1–2]．微藻在不同生長時期脂肪酸組成和含量差別很大，(n-3)HUFAs的產(chǎn)量可因在藻類生長的特殊時期進(jìn)行收獲而達(dá)到最大值．關(guān)于生長時期對微藻脂肪含量和脂肪酸組成的影響已有多個報道[3–10]，但國內(nèi)外對裂絲藻的研究則未見報道．本文對 1株裂絲藻和 3株小球藻共 4株綠藻在不同生長時期培養(yǎng)時其脂肪含量和脂肪酸組成進(jìn)行了測定，以期找出其生長和脂肪酸合成的最適條件，為微藻的不飽和脂肪酸研究提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 藻種

實驗所用微藻藻種取自中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(MACC)：小球藻 Chlorella spp. MACC/C95、MACC/C97、MACC/C102和桿狀裂絲藻Stichococcus bacillaris MACC/C19．

1.2 培養(yǎng)條件

對 4株藻種作不同生長時期(指數(shù)期、穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期)的培養(yǎng)實驗．其中海水經(jīng)沉淀后用脫脂棉過濾，煮沸消毒．采用f/2培養(yǎng)基．實驗于2,L細(xì)口瓶中進(jìn)行，連續(xù)充氣，連續(xù)光照(4,500,lx)，培養(yǎng)液鹽度為 28‰，室溫(20±1)℃．每天用血球計數(shù)板法計數(shù)細(xì)胞濃度．

1.3 微藻收獲

微藻在指數(shù)生長末期至穩(wěn)定前期 4,000,r/min離心收獲，真空干燥．

1.4 脂肪測定

采用索氏抽提法．

1.5 脂肪酸分析

樣品處理及氣相色譜分析按文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行.取 40,mg樣品于離心管中，加入體積比為 2∶1的氯仿和甲醇溶液 10,mL，振蕩后加入 2,mol/L的NaOH/CH3OH 溶液 1,mL，充分振蕩，75,℃水浴加熱15,min進(jìn)行皂化，冷卻后加入 2,mol/L 的HCl/CH3OH 溶液，調(diào)節(jié) pH≤2，在 75,℃水浴中加熱15,min，使其甲酯化，然后加入 1,mL的正己烷振蕩，取上清液進(jìn)行色譜分析．

氣相色譜分析采用美國 HP5890Ⅱ型氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器，Coawax carbowax毛細(xì)管柱(30,m×0.25,mm)，進(jìn)樣口和檢測器溫度均為280,℃，程序升溫，載氣為高純氮，流量2,mL/min，進(jìn)樣量1,μL．以面積歸一法得到各脂肪酸組分的相對含量．各個脂肪酸的鑒定通過比較實驗樣品色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖以及各脂肪酸的出峰時間來進(jìn)行．

1.6 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)差及單因子方差分析由 Excel軟件處理分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示．

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪含量

不同生長時期對 4株綠藻的脂肪含量的影響見表 1．結(jié)果表明，生長時期對 4株綠藻的脂肪含量影響顯著(P＜0.05)．從表 1可以看出：C19、C95和C97的脂肪含量隨生長時期的延長呈增加趨勢．C19的脂肪含量在穩(wěn)定后期達(dá)到最大值(33.7%)；C95和C97的脂肪含量在指數(shù)期和穩(wěn)定前期之間隨生長時期的延長顯著增加，而在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期之間增長緩慢(分別為 16.6%～19.2%和 27.7%～32.1%)；C102的脂肪含量在指數(shù)期和穩(wěn)定前期之間呈增加趨勢，并在穩(wěn)定前期獲得脂肪含量的最大值(28.1%)，之后則隨生長時期的延長有所下降．

2.2 脂肪酸組成

不同生長時期(指數(shù)期、穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期)對4株綠藻脂肪酸組成的影響見表 2．結(jié)果表明：16∶0(19.5%～39.8%)，16∶1(n-7)(21.9%～32.9%)，18∶1(n-9)(3.1%～14.7%)，20∶4(n-6)(1.9%～4.8%)和EPA(6.7%～28.4%)是 4株綠藻的主要脂肪酸成分，生長時期對 4株綠藻的主要脂肪酸成分含量影響顯著(P＜0.05)．

表2 不同生長時期4株綠藻的主要脂肪酸組成Tab.2 Fatty acid compositions in the four strains of green algae at different growing phases %

由表2可以看出：4株綠藻的脂肪酸組成和含量隨生長時期變化較大．裂絲藻 C19和 3株小球藻C95、C97和 C102中的 EPA含量均在指數(shù)期最高，分別可達(dá)17.3%、28.1%、28.4%和14.8%．C19的20∶4(n-6)含量在各生長時期保持穩(wěn)定，16∶1(n-7)在穩(wěn)定前期含量最低，而在指數(shù)期和穩(wěn)定后期含量較大．16∶0含量隨生長時期而增加，14∶0則在各生長時期變化不明顯．

小球藻 C95的 20∶4(n-6)、18∶3(n-3)和 16∶1(n-7)含量隨生長時期的延長而減少，而 18∶1(n-9)、16∶0、14∶0含量則隨生長時期的延長而增加，在指數(shù)期和穩(wěn)定前期有極低的 DHA含量．C97的14∶0和 16∶1(n-7)含量在各生長時期基本穩(wěn)定，16∶0和 18∶1(n-9)含量在指數(shù)期和穩(wěn)定前期較為穩(wěn)定，而在穩(wěn)定后期有顯著增加．18∶3(n-3)含量在穩(wěn)定前期含量較低，而在指數(shù)期和穩(wěn)定后期較高．20∶4(n-6)含量在指數(shù)期和穩(wěn)定前期較為穩(wěn)定，而在穩(wěn)定后期明顯降低．18∶1(n-7)在穩(wěn)定前期有較多含量(4.0%)，而在穩(wěn)定后期降為 0.1%，指數(shù)期未檢出．C102的 20∶4(n-6)含量在指數(shù)期較高，在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期含量降低．18∶3(n-3)含量在穩(wěn)定前期最低，而在指數(shù)期和穩(wěn)定后期都會增加．16∶1(n-7)含量在各生長時期保持穩(wěn)定，16∶0含量隨生長時期的延長而增加，14∶0含量則隨生長時期的延長而降低．

C19的單不飽和脂肪酸(MUFA)總量在各生長時期變化不大，飽和脂肪酸(SFA)總量則隨生長時期的延長略有增加，HUFAs含量在指數(shù)期較高，而在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期含量降低但較為穩(wěn)定．C95和C97的SFA總量隨收獲期的延長而有顯著增加，C102的SFA含量隨生長時期呈升高趨勢．C95的MUFA總量在各生長時期保持穩(wěn)定，C97的 MUFA在指數(shù)期和穩(wěn)定前期保持穩(wěn)定，而到穩(wěn)定后期有顯著升高，C102的MUFA在指數(shù)期含量較低，而在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期有明顯升高且保持穩(wěn)定．3株小球藻 C95、C97、C102的多不飽和脂肪酸含量HUFAs總量隨收獲時期的延長而有明顯的降低．

3 討 論

在本實驗結(jié)果中，4株綠藻的主要脂肪酸組成為14∶0、16∶0、16∶1(n-7)、18∶1(n-9)、18∶3(n-3)、20∶4(n-6)和 EPA，DHA含量很少或不含，符合綠藻綱的脂肪酸特征[11–12]．4株綠藻的脂肪含量均隨生長時期的延長而增加，表明脂肪在穩(wěn)定期積累．有報道[13–14]認(rèn)為細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后，培養(yǎng)基中氨基酸合成所必需的氮減少了，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成量降低，光合作用所同化的碳進(jìn)入到碳水化合物和脂肪中，出現(xiàn)能量積累的趨勢．Mansour等[9]的實驗結(jié)果表明，Gymnodinium sp.的脂肪含量在穩(wěn)定期(第 43天)比指數(shù)期(第 6天)時提高了 30倍．魏東等[15]對Ellipsoidion sp.和 Nannochloropsis oculata 的研究結(jié)果也表現(xiàn)出了相同的規(guī)律．

研究結(jié)果顯示指數(shù)期 HUFAs含量較高，這是由于指數(shù)期藻細(xì)胞生長旺盛，光合效率高，類囊體數(shù)量及表面積增加，極性甘油脂(含有較多的HUFA)作為類囊體膜的主要組分，其含量相應(yīng)升高[16]．Piorreck等[17]通過對小球藻Chlorella vulgaris的研究指出，綠藻的脂肪酸組成及含量隨生長時期而改變，在生長起始階段綠藻能產(chǎn)生大量的極性脂肪和16碳、18碳多不飽和脂肪酸，而生長后期，綠藻的主要脂肪變?yōu)橹行郧襇UFA和SFA的含量大增．Liang等[5–6]報道了Chaetoceros gracilis(MACC/B13)、Cylindrotheca fusiformis(MACC/B211)、Phaeodactylum tricornutum(MACC/B221)和 Nitzschia closterium (MACC/B222)的HUFAs和EPA含量在指數(shù)期最高，隨生長時期的延長其含量減少；4株筒柱藻 Cylindrotheca(B156、B164、B196、B200)的 HUFAs均在指數(shù)期或穩(wěn)定前期達(dá)到高峰．Fidalgo等[7]的研究結(jié)果表明 Isochrysis galbana的 HUFAs含量在穩(wěn)定前期達(dá)到最大值，隨后在穩(wěn)定期逐漸降低．Lin等[8]的結(jié)果表明I.,galbana CCMP 1324的SFA、MUFA以及HUFA含量均在穩(wěn)定前期達(dá)到最大值．李文權(quán)等[10]的結(jié)果表明I.,galbana、Dunaliella salina 和 Chlorella sp.的總多不飽和脂肪酸(THUFA)含量在指數(shù)期明顯高于穩(wěn)定期，其中 D.,salina 的 18∶3(n-3)、Chlorella sp.的EPA和I.,galbana的DHA含量均在指數(shù)期達(dá)到最大值．本實驗結(jié)果顯示，4株綠藻的EPA和HUFAs含量均隨生長時期的延長而下降，C19、C95和C102中的 EPA含量在指數(shù)期達(dá)到最大值，C97在指數(shù)期和穩(wěn)定前期 EPA 含量較高，穩(wěn)定后期顯著降低；C19、C95、C97和C102的HUFAs含量均在指數(shù)期達(dá)到最大值，與上述結(jié)果一致．

生長時期對微藻脂肪酸的影響因種而異．三酰甘油含量高的藻類中含有相對高比例的飽和脂肪酸及單烯酸，而 HUFA 較少[4,18–20]．Fernández-Reiriz等[3]報道了生長時期對微藻的 EPA和 DHA影響因種而異．Mansour等[9]的結(jié)果表明 Gymnodinium sp.的18∶5(n-3)和 EPA 隨培養(yǎng)時間而減少，而 DHA 含量隨培養(yǎng)時間增加．Dustan等[4]報道了 N.,oculata在指數(shù)期 HUFAs相對含量最高，Pavlova lutheri在穩(wěn)定前期 HUFAs相對含量最高，而 Isochrysis sp.的HUFAs含量隨生長時期變化不明顯．Hopley等[21]也報道了C.,vulgaris(CCAP211/8,K)和(CCAP211/11C)的脂肪酸組成在指數(shù)期和穩(wěn)定期沒有明顯的變化．

［1］ Grima E M，Perez J A S，Sanchez J L G. EPA from Isochrysis galbana growth conditions and productivity[J]. Process Biochemistry，1992，27：299-305.

［2］ Yongmantichai W，Ward O P. Growth of and omega-3 fatty acid production by Phaeodactylum triconutum under different culture conditions[J]. Applied and Environmental Microbiology，1991，57(2)：419-425.

［3］ Fernández-Reiriz M J，Perez-Camacho A，F(xiàn)erreiro M J，et al. Biomass production and variation in the biochemical profile(total protein，carbohydrates，RNA，lipids and fatty acids)of seven species of marine microalgae[J].Aquaculture，1989，83(1/2)：17-37.

［4］ Dunstan G A，Volkman J K，Barrett S M，et al. Changes in the lipid composition and maximization of the polyunsaturated fatty acid content of three microalgae grown in mass culture[J]. Journal of Applied Phycology，1993，5(1)：71-83.

［5］ Liang Ying，Mai Kangsen. Effect of growth phase on the fatty acid compositions of four species of marine diatoms[J]. Journal of Ocean University of China，2005，4(2)：157-162.

［6］ Liang Ying，Mai Kangsen，Sun Shichun. Effects of harvest stage on the total lipid and fati1y acid composition of four Cylindrotheca strains[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2002，20(2)：157-161.

［7］ Fidalgo J P，Cid A，Torres E，et al. Effects of nitrogen source and growth phase on proximate biochemical composition，lipid classes and fatty acid profile of the marine microalga Isochrysis galbana[J]. Aquaculture，1998，166(1/2)：105-116.

［8］ Lin Y H，Chang F L，Tsao C Y，et al. Influence of growth phase and nutrient source on fatty acid composition of Isochrysis galbana CCMP 1324 in a batch photoreactor[J]. Biochemical Engineering Journal，2007 ，37(2)：166-176.

［9］ Mansour M P，Volkman J K，Blackburn S I. The effect of growth phase on the lipid class，fatty acid and sterol composition in the marine dinoflagellate，Gymnodinium sp. in batch culture[J]. Phytochemistry，2003，63(2)：145-153.

［10］ 李文權(quán)，廖啟斌，李芊，等. 三種海洋微藻生長期脂肪酸組成研究[J]. 海洋環(huán)境科學(xué)，2002，21(2)：10-13.

［11］ Volkman J K，Jeffrey S W，Nichols P D，et al. Fatty acid and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，1989，128(3)：219-240.

［12］ 俞建江，李荷芳，周漢秋. 10種海洋微藻總脂、中性脂和極性脂的脂肪酸組成[J]. 水生生物學(xué)報，1999，23(5)：481-488.

［13］ Zhu C J，Lee Y K，Chao T M. Effects of temperature and growth phase on lipid and biochemical composition of Isochrysis galbana TK1 [J]. Journal of Applied Phycology，1997，9(5)：451-457.

［14］ Aaronson S. Effect of incubation temperature on the macromolecular and lipid content of the phytonagellate Ochromonas danica [J]. Journal of Phyco1ogy，1973，9：111-113.

［15］ 魏東，張學(xué)成. 細(xì)胞生長時期對兩種海洋微藻總脂含量和脂肪酸組成的影響[J]. 青島海洋大學(xué)學(xué)報，2000，30(3)：503-509.

［16］ 石娟，潘克厚. 不同培養(yǎng)條件對微藻總脂含量和脂肪酸組成的影響[J]. 海洋水產(chǎn)研究，2004，25(6)：79-85.

［17］ Piorreck M，Pohl P. Formation of biomass，total protein，chlorophylls，lipids and fatty acids in green and bluegreen algae during one growth phase [J]. Phytochemistry，1984，23(2)：217-224

［18］ Suen Y，Hubbard J S，Holzer G，et a1. Total lipid production of the green alga Nannochlorepsis sp. QII under different nitrogen regimes[J]. Journal of Phyco1ogy，1987，23(S2)：289-296.

［19］ Hodgson P A，Henderson R J，Sargent J R，et a1. Patterns of variation in the lipid class and fatty acid composition of Nannochloropsis oculata(Eustigmatophyceae)during batch culture I. The growth cycle [J]. Journal of Applied Phyco1ogy，1991，3(2)：169-181.

［20］ Roessler P G. Environmental control of glycerolipid metabolism in microalgae：Commercial implications and future research directions[J]. Journal of Phyco1ogy，1990，26(3)：393-399.

［21］ Hopley A，F(xiàn)allowfield H J. The effect of nitrogen，temperature and growth phase on the fatty acid composition of microalgae[J]. Journal of Phyco1ogy，1989，25(S2)：9-15.