重組人細胞外基質磷酸化糖蛋白對人牙髓細胞體外礦化的影響

艾林　王慧媛　霍麗　李明勇

[摘要]目的：探討細胞外基質磷酸化糖蛋白（Matrix extracellular phosphoglycoprotein，MEPE）對人牙髓細胞（human dental pulp cells，HDPCs）在體外的礦化能力的影響，從而了解該蛋白在牙齒生長發育過程中的作用。方法：常規方法培養獲得人牙髓細胞，實驗組中使用的MEPEs的濃度為100μg/L。通過Von kossa染色觀察MEPE對人牙髓細胞礦化的影響。結果：MEPE蛋白能促進人牙髓細胞的礦化。結論：MEPE具有促進人牙髓細胞的礦化的能力，可能在牙齒生長發育過程中起著重要的作用。

[關鍵詞]牙髓細胞；礦化；細胞外基質磷酸化糖蛋白

[中圖分類號]Q813.1 Q591.2 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）05-0542-03

這些年來， 牙髓生物學已變為口腔內科學研究領域的重點和熱點。在牙髓生物學的研究過程中人牙髓細胞是其中最重要細胞來源，這是因為人牙髓細胞容易獲取，并且容易在體外培養擴增，同時具有成骨能力確切以及多向分化潛能的優點。骨組織和成牙本質細胞中可以表達細胞外基質磷酸化糖蛋白（Matrix extracellular phosphoglycopro tein，MEPE）。成牙本質細胞分泌的MEPE，可以運至細胞外基質中，可能在牙髓細胞的分化以及牙髓牙周組織的礦化過程中發揮重要作用。目前關于MEPE蛋白的確切功能還沒有明確結論，而MEPE蛋白的生物學功能可以通過組織表達的特點進行研究。本實驗擬通過細胞培養技術，組織化學，體外礦化實驗等方法，研究MEPE在牙髓生理反應中的作用機制，同時觀察MEPE對體外培養的人牙髓細胞礦化能力的影響， 為臨床應用MEPE提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器：重組人MEPE蛋白；兔SP Kit（上海生工公司，中國）；噻唑鹽（GIBCO，美國）；DMEM培養液（AMERSCO，美國）；牛血清白蛋白（BSA）（北京中山生物技術有限公司，中國）；胎牛血清（FBS）（GIBCO，加拿大）；倒置、相差顯微鏡（Nikon，日本）；CO2細胞培養箱（北京中山生物技術有限公司，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人牙髓細胞的體外培養：選擇12～18歲因正畸需要拔除的恒牙。拔除后在無菌條件下分離牙髓組織，放置于含鏈霉素、青霉素、兩性霉素 B （濃度均為10mg/L）的 PBS 溶液里。在PBS溶液中浸泡3次，每次5min。然后把牙髓組織剪切成1mm大小的碎塊，把組織塊平鋪在含有Ⅰ型膠原的25cm DMEM培養瓶里，其中每瓶約含30塊牙髓組織塊。把含有牙髓組織塊的DMEM培養瓶在CO2細胞培養箱（37℃，5% CO2）中培養。當觀察到原代培養組織細胞塊周圍長出細胞后，使用倒置顯微鏡觀察組織貼壁的情況。培養過程中每周換液至少1次，當細胞長滿2/3瓶時，使用0.01 %EDTA 和0.25 %胰酶的混合溶液，以1∶1進行消化，并且按 1∶2 進行傳代培養。傳到第6代作細胞學檢測。

1.2.2 MEPE的配制及分組：用PBS緩沖液將MEPE凍干粉配成1g/L的溶液，再將濃度稀釋為100μg/L進行實驗。

1.2.3 Von kossa染色：實驗分組放置于96孔培養板內，將傳代培養人牙髓細胞以1×106/cm2濃度接種于培養板內，每孔加入0.5ml。DMEM培養液中含φ=10%FCS、50μg/ml L-抗壞血酸10μmol/L β-磷酸甘油。φ（CO2）=5%、飽和濕度37℃環境下培養。每3天更換培養液，培養至第28天，吸除培養液，PBS漂洗3遍。加入40g/L多聚甲醛，4℃低溫下固定24h。采用Von kossa法進行鈣鹽沉積染色。吸除固定液，PBS振洗3次，每次5min。將培養板浸沒于50g/L硝酸銀溶液中，室溫下浸泡2h。取出后蒸餾水反復沖洗3遍。浸入30g/L硫代硫酸鈉溶液中浸泡5min，取出后充分水洗，蒸餾水漂洗3遍。滴入10g/L中性紅襯染1min。酒精脫水，二甲苯透明，封固，鏡檢。

2 結果

2.1 人牙髓細胞的生長：使用倒置相差顯微鏡觀察，在接種兩天后，牙髓細胞開始貼壁， 這時出現大量增殖， 第6天可見大量克隆細胞，細胞表面及四周有大量紅細胞。換去全部液體，洗去大部分紅細胞，鏡下貼壁細胞成不規則三角形或紡錘形，成纖維細胞集落樣方式生長， 并且可以觀察到長短不同的突起（圖1），證明人牙髓細胞培養成功。

2.2 Von kossa染色結果見圖2。

3 討論

牙本質是重要的牙體組織，它具有一些重要的生理功能，是構成牙齒的主體，也承擔著感覺、修復等重要作用。生物礦化是目前口腔醫學研究的的重點和熱點，這項研究可以闡明牙齒的形成，了解牙體牙髓損傷修復的機制以及指導齲病的臨床治療。目前普遍認為細胞外基質蛋白在此過程中起到重要的作用。

MEPE，又稱成骨細胞或骨細胞因子45（Osteoblast/Osteocyte Factor 45；OF45）被歸為 SIBLING （Small Integrin-Binding LIgand，N-linked Glycoprotein）家族。MEPE與骨橋素（osteopontin，OPN），釉蛋白（enamelin，ENAM）等在基因水平和蛋白質水平的結構以及功能等多方面具有相當多的相似之處。 2000年，Rowe等[1]發現了MEPE，該研究組進行RT-PCR腫瘤性低血磷性骨軟化癥（oncogenic hypophosphatemic osteomalacia，OHO）患者腫瘤組織的cDNA文庫，發現文庫的基因檢測表達上調，該研究組發現MEPE可以在骨髓和大腦中表達，然而在腎、肺以及胎盤等組織中的表達水平比較低。Petersen等[2]在成骨細胞中克隆到MEPE基因，該研究組進行了組織免疫化學以及Northern blot等研究，其結果顯示：MEPE在皮質骨和骨小梁中的骨細胞出現高表達，而且只表達在骨組織中。Heinrich等[3]發現MEPE不僅在骨細胞表達而且也可以在成骨細胞中表達。

MEPE在口腔醫學研究方面的論著很少。有學者[4]認為MEPE可以在成牙本質細胞中表達，是牙本質發育異常性疾病的重要候選基因，該研究組發現MEPE與II型牙本質發育不良以及II牙本質發育不全等疾病的病因相關。有學者將MEPE植于大鼠牙髓腔中，一個月天后鏡下可見形成大量修復性牙本質，結果顯示MEPE可能可以促進牙髓細胞分化成為成牙本質細胞[5]。

在組織生長發育過程中，細胞外基質蛋白作為一種必需的信號分子，是細胞分化和附著的底物，其提供細胞生長的信號，控制細胞的附著并且為組織和細胞提供機械支持作用，細胞的生長和功能也受細胞外基質的影響。因此，細胞外基質是細胞進行增殖、遷移和分化的前提[6-9]。本實驗通過Von kossa染色觀察MEPE對人牙髓細胞礦化的影響，發現MEPE蛋白可以促進人牙髓細胞的礦化，也就意味著MEPE蛋白在牙齒生長發育過程中起著重要的作用。本實驗初步探討了MEPE蛋白對人牙髓細胞礦化能力的影響，但是關于MEPE的分子機理研究還需不斷深入。

[參考文獻]

[1]Rowe PS， de Zoysa PA， Dong R，et al.MEPE， a new gene expressed in bone marrow and tumors causing osteomalacia[J]. Genomics，2000， 67（1）：54.

[2]Petersen DN，Tkalcevic GT，Mansolf AL，et al. Identification of osteoblast/osteocyte factor 45 （OF45）， a bone-specific cDNA encoding an RGD-containing protein that is highly expressed in osteoblasts and osteocytes[J]. J Biol Chem，2000，275（46）： 36172.

[3]Heinrich J，Pavlin D，Yang W，et al. MEPE expression in osteocytes during orthodontic tooth movement[J]. Achives of oral biology，2011，52（6）： 684-690.

[4]Mac Dougall M， Simmons D，Gu TT， et al. MEPE/OF45， a new dentin/bone matrix protein and candidate gene for dentin diseases mapping to chromosome 4q21[J].Connect Tissue Res，2009，43（2-3）：320.

[5]Hanguo Wang， Nobuyuki Kawashima， Takanori Iwata， Jing Xu， Satomi TakahashiToshihiro Sugiyama， Hideaki Suda. Differentiation of odontoblasts is negatively regulated by MEPE via its C-terminal fragment[J].Biochem Biophys Res Communicat，2010，398（5）：406-412.

[6]Robey PG. Bone matrix proteoglycans and glycoprotein. Principles of Bone Biology[M].San Diego： Academic Press，1996：155.

[7]Nagel DE，Khosla S，Sanyal A，et al. A fragment of the hypophosphatemic factor， MEPE， requires inducible cyclooxygenase-2 to exert potent anabolic effects on normal human marrow osteoblast precursors[J]. J Cell Biochem， 2012， 93（6）： 1107-1114.

[8]Argiro L，Desbarats M，Glorieux FH，et al.Mepe，the gene encoding a tumor-secreted protein in oncogenic hypophosphatemic osteomalacia，is expressed in bone[J].Genomics，2011，74（3）：342.

[9]Qin C，Baba O，Butler WT. Post-translational modifications of sibling proteins and their roles in osteogenesis and dentinogenesis[J].Crit Rev Oral Biol Med，2009，15（3）：126.

[收稿日期]2013-01-22 [修回日期]2013-03-21

編輯/張惠娟