生物學研究領域值得關注的技術

奇云

在2013年乃至未來幾年內，生物學研究領域重要技術發展有哪些？對此，世界著名科學雜志《自然-方法》（Nature Methods）邀請生物科學和相關學科的專家進行研討，得出的結論是：納米孔測序、微生物組功能研究、近紅外熒光成像、鉆石氮空泡中心成像、構建干細胞體外微環境、快速容積成像、蛋白復合體無損質譜鑒定和機器自動分辨表型等8大技術值得關注。

NO.1

納米孔測序

近年來，激烈的競爭使得DNA測序技術迅猛發展。現在，一種叫做納米孔測序的技術猶如一匹黑馬闖入大家的視線，看起來很有潛力在競爭中拔得頭籌。

納米孔測序技術，是借助電泳驅動單個分子逐一通過納米孔來實現測序的。由于納米孔的直徑非常細小，僅允許單個核酸聚合物通過，因而可以在此基礎上使用多種方法來進行高通量檢測。納米級別的孔徑保證了檢測具有良好的持續性，在測序過程中起始DNA不會被破壞，所以測序的準確度非常高。錯誤率目前介于1%～4%之間，并且是隨機分布的，而不是扎堆在讀取序列的兩端。

納米孔測序技術還有一個非常吸引人的優勢，那就是測序距離長。從原則上來說，使用納米孔測序技術，只要DNA鏈不發生斷裂，并且能一直通過納米孔，就可以一直檢測下去。對于長達1000個堿基的單鏈DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本無需進行擴增或標記，就可以使用納米孔測序技術進行檢測。

這種先進的技術有可能將完整測出人類基因組的費用降低到1000美元以下，為個體化醫療帶來革命，并將基于遺傳學的診療及醫學帶入新的時代。《自然-方法》雜志在介紹納米孔測序時，使用了“具有顛覆性的技術”一詞來形容。在2012年基因組生物科學與技術進展研討會上，牛津納米孔科技公司宣布將推出第一款商品化的納米孔測序儀，隨即引起了科學界的廣泛關注。專家們預測，納米孔測序技術有望彌補現有測序平臺所存在的缺陷。

NO.2

微生物組功能研究

隨著高并行測序技術和高通量質譜技術的發展，微生物學已經進入了一個新時代，從單菌株的分離研究時代進入微生物群落整體研究時代。微生物組是指微生物的總和，包括在一個特定的環境中所有微生物的遺傳物質及其與環境之間的相互作用。這個特定的環境，可以是人的胃，或是一份土壤樣品。

人體內有兩個基因組，一個是從父母那里遺傳來的人基因組，編碼大約2.5萬個基因；另一個則是出生以后才進入人體的多達1000多種的共生微生物，其遺傳信息的總和叫“微生物組”，它們所編碼的基因有100萬個以上。在研究基因與人體健康關系時，一定不能忽略共生微生物組功能的研究。為此，美國推出了“人類微生物組計劃”項目，歐盟也推出了相應的“人類腸道宏基因組學計劃”。另外，法國、日本、加拿大等國還單獨為微生物組學研究設立了專項。2012年，人類微生物組計劃首次全面精確地公布了人類正常微生物構成，并創建了一個龐大的參考數據庫，這將加速傳染病研究的進程。

微生物組功能研究技術的發展，將打破醫學微生物和環境微生物之間的界限，不僅能夠為處理醫學問題、疾病治療提供新思路和新方法，還能讓人們根據個人生理特點及飲食習慣，來控制自己體內微生物組成，從而改善健康狀況，甚至治療疾病。

NO.3

近紅外熒光成像

生物活體內的血紅蛋白、水和脂質對光譜范圍大約在650納米–900納米的近紅外熒光的吸收系數最低，進而與可見光相比近紅外熒光可穿透更深層的組織。近紅外熒光成像的基本原理是以特定波譜范圍的激發光源照射熒光分子（近紅外熒光探針），此時熒光分子被激發出不同光譜特性的光子信號，此信號通過濾光片后由超敏CCD照相機采集，然后通過高級數據處理技術將光子信號轉換為圖像。

通過活體動物近紅外熒光成像，可以觀測到疾病或癌癥的發展進程以及藥物治療所產生的反應，并因為近紅外線熒光成像中高特異性的智慧探針可以反映機體某些特殊酶類的活動情況，所以該技術可用來檢測體內或體外的某些酶的表達，即可用于基因治療的療效評定和特殊標記基因的顯像，以及用于腫瘤的生長、血管生成、轉移中特殊酶類的活動情況的監測等。這項新型的成像技術還可用于風濕性關節炎和類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化、血栓形成等疾病的研究。

近紅外熒光成像的核心是近紅外探針。目前，近紅外探針有很多種，包括靶定的近紅外熒光染料、活性的近紅外熒光染料、紅移的熒光蛋白和生物熒光探針等等。近紅外熒光成像技術的未來發展主要為各種特異靶向探針和聰明探針的合成，并將其應用于不同疾病的實驗性研究，且主要集中于腫瘤、炎癥和心血管疾病的早期診斷及療效的動態監測，從分子水平為疾病的發生、發展、轉歸提供信息。

NO.4

鉆石氮空泡中心成像

對于生物學家而言，鉆石的最大用途，來自于鉆石的有特定缺陷、高度規整的碳晶格結構。這種所謂的缺陷，指的是在碳晶格結構中有一些氮原子附近缺失了一些碳原子，這就形成了所謂的“氮空泡中心”。不過，這種不完美的結構卻能夠發出不容易被光猝滅的熒光，而且只有4納米大小的鉆石同樣具備這種特性。再加上鉆石是由碳原子構成的，所以也具有極佳的生物相容性。

現在，納米鉆石已經被用于活體動物成像當中，主要被當作探針使用。在超高分辨率顯微鏡下，這些鉆石還表現出了非常優異的定位精確性。不過這些鉆石現在還不太能夠用作細胞探針，因為它們還不如其他的遺傳學探針好用，但是正在開發的功能和靶向技術有望改變這一現狀。在熒光共振能量轉移過程中，氮空泡中心是一種高效的染料受體分子供體，而且可以被用來開發出各種新型的感受器。

不過氮空泡中心最吸引人的潛在用途，還是來自其異常的電子自旋狀態。這種電子自旋態對于磁場非常敏感，而且還能夠發射熒光，通過熒光顯微鏡就可以觀察到這種熒光。在原子力掃描顯微鏡上使用一個氮空泡中心，就可以得到一幅非常漂亮的磁場照片。將這種技術進一步小型化之后，就可以得到一款微型的臺式核磁共振成像儀，它能方便地對單分子蛋白質進行結構測定。

NO.5

重建干細胞體外微環境

人體內的各種干細胞都有適合它們各自需求的生存微環境，這種微環境被稱作微生態系統，是確保干細胞能夠發揮出正常功能的關鍵。所以，科研人員對于干細胞與所在位置微環境之間的關系非常感興趣。其中有一個研究方向，就是希望在體外細胞培養環境中，重建出適合干細胞生存的微環境。

科學家們之所以想要在體外細胞培養環境中，復制適合干細胞生存的微環境有兩個目的。首先，有了這種適宜干細胞生長的條件，就可以在體外對干細胞進行大規模的培養。其次，這還有利于科學家了解干細胞與微環境之間的相互作用關系，同時還可以通過改變微環境與干細胞之間的相互作用方式來構建干細胞病理模型。

在重建干細胞體外培養微環境時，有一種相對比較簡單的方式可供選擇，那就是對干細胞和間質細胞，或者其他在體內就位于干細胞周圍的細胞進行共同培養。不過，要完全復制出這樣一套和體內真實環境一樣復雜的、能夠發生動態變化的干細胞生活微生態系統，還不是那么容易的。因為雖然構成微環境的其它因素都差不多，比如可溶性的信號分子、粘附信號分子、細胞間的相互作用、細胞與胞外基質之間的相互作用、構成微生態立體結構的機械力以及代謝產物、氧氣等受到系統調控的其他因素等，但是適應每一種干細胞生存的微環境在細節上都會有一些差別。

NO.6

快速容積成像

對生物樣品進行的三維熒光成像操作，通常都是依靠多次拍攝之后將多個二維圖像疊加的方式完成的。不過這種方式費時費力，而且并不適合記錄瞬間的圖像，同時也不太適用于拍攝對光敏感的樣品。快速容積成像新技術采用的則是另外一種策略，使用這種技術可以只通過一次拍攝就得到一幅完整的三維圖像。美國斯坦福大學的科學家之前也曾經設計了一臺能夠拍攝立體照片的光場顯微鏡。這種顯微鏡其實就是在傳統光學顯微鏡的主鏡片和傳感器之間又加上了一組顯微透鏡。在傳統顯微鏡中原本會穿過焦點的光線，到了這臺光場顯微鏡下，會轉而穿過那組顯微透鏡。這些光線然后分別會被光場檢測板記錄下來，這樣被拍攝樣品中的每一個不同的點，都會以不同圖像的方式被記錄下來。然后再用重疊合算法對圖像進行處理，最終每一幅圖像都會是一幅三維立體透視圖像。

這種顯微鏡拍攝的三維圖像包含了足以滿足我們需要的信息。斑馬魚幼體大腦中鈣熒光蛋白分布三維圖像就是個很好的例子。日本國立遺傳學研究所的科研人員在通體透明的斑馬魚幼魚身上進行了測試。他們搭建起液晶顯示屏，用以向靜止的斑馬魚幼魚的一側展示閃爍的點。隨著點的出現和消失，研究人員觀察到相應的閃光自斑馬魚的頂蓋位置發出，而這反映了它的神經活動。當科學家把閃爍點從左側移動到右側，或從上方移到下方時，他們又在頂蓋位置看到了水平和垂直方向的大腦信號。研究小組隨后引入了活體草履蟲。其被放置在幼魚的頭部附近，當它開始游動時，斑馬魚腦部的信號便會和獵物的運動步調趨于一致。

NO.7

蛋白復合體無損質譜鑒定

細胞中的每個蛋白質通常以蛋白復合體的形式實現特定生物學功能，所以識別和分析蛋白復合體的組分是研究蛋白功能所必需的。但由于蛋白質鑒定的困難，大多數蛋白復合體都是未知的。解析和鑒定蛋白復合體的最常用方法是利用抗體做免疫共沉淀分離復合體，再使用質譜方法鑒定復合體的組成成分并研究相關蛋白質的功能。

在絕大多數情況下，使用質譜技術對蛋白質進行分析時采用的都是“鳥槍法”分析策略，即首先將待檢測的蛋白質分解成不同大小的肽段，然后再進行分析。雖然目前這種鳥槍測序法已經可以用于高通量的蛋白質組鑒定工作，但是在鑒定過程當中還是會丟失很多重要的生物學信息。我們知道蛋白質上經常會攜帶各種翻譯后修飾信息，比如磷酸化等修飾信息，這些修飾物對蛋白質的功能都具有非常重要的影響作用，可是當蛋白質被分解成小片段之后我們就很難讀取到這類修飾物的信息。不過新開發的一項質譜檢測技術就可以對蛋白質或者蛋白復合體進行無損鑒定，今后這些重要的蛋白質功能信息就再也不會被遺漏了。在這種新技術下，蛋白質首先會經過比較輕柔的離子化處理，使其變為氣態，此時蛋白質還會保留原有的三維立體結構，而且在合適的條件下，即便是更大的、以非離子鍵結合的、可溶性的膜蛋白復合體都可以保持原本的狀態。

NO.8

機器自動分辨表型

識別細胞或者是模式生物的各種表型，通常都需要進行各種視覺上的辨別。比如：使用某種信號激活劑或者抑制劑之后，某種蛋白的細胞定位會發生哪些變化？某個特定基因突變或者被敲除之后，果蠅頭部外形會發生哪些改變，或者小鼠的活動會出現哪些變化？對這些表型進行人工辨別，會是一項非常繁重的任務。尤其是在需要觀測大量樣本的情況下，更是讓人難以承受。現在科學家們提出可以利用計算機，機器自動分辨生物表型。

要計算機進行表型識別，需要對機器進行訓練，教會它們自己訓練自己。要做到這一點，首先就要讓機器學會如何從圖像中挑選出可以進行表型識別的有用信息。這些圖像信息有可能是靜態的，也有可能是動態的；可以是細胞的圖像，也可能是模式生物的圖像或者是其它一些圖像。研究者可以事先根據實驗結果對各種表型進行基本的注釋和分類，也可以讓機器對其自動進行分類。

這種自動表型篩選儀，尤其適用于對成千上萬個樣品進行大規模篩查的工作。自動表型分選技術除了可以對表型進行定性的分選之外，還可以進行定量分選，此時需要對比較細微的表型差異進行鑒別，或者需要對大量的樣本進行表型鑒別，然后進行統計學分析得出結論。此外，還可以對行為學表型進行鑒別，并自動進行錄像，記錄一定時間之內的表型變化等。

科學家們近期公布了一項這方面的最新研究成果——利用一種人工智能和前沿圖像加工的自動化系統，快速檢測了大量的個體秀麗隱桿線蟲。這一系統無需人為干預就能夠檢測到線蟲間的細微差異，而且能鑒別出用其他方式有可能無法檢測到的遺傳突變。

（作者單位：淮南聯合大學）