辛伐他汀對人牙髓干細胞成骨活性的影響

運慧媛　袁夢桐　劉明月　王鈺瑩　繆宏穎

[摘要]目的：研究辛伐他汀對人牙髓干細胞成骨活性的影響。方法：將體外分離培養的人牙髓干細胞分別接種于含有不同濃度辛伐他汀的礦化培養液中誘導培養，測定堿性磷酸酶活性及骨唾液酸蛋白基因的表達情況。結果：與對照組比較，適宜濃度辛伐他汀（1×10^-6mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-8mol/L）促進人牙髓干細胞的成骨活性作用更為明顯，差異具有統計學意義（P<0.05），當辛伐他汀濃度為1×10^-7mol/L時，促進作用最顯著。結論：適宜濃度的辛伐他汀可以有效促進人牙髓干細胞的成骨活性。

[關鍵詞]牙髓干細胞；辛伐他汀；成骨活性

[中圖分類號]Q813.1 R782.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）06-0644-04

辛伐他汀為一種無活性的內酯類結構藥物，口服后在肝臟中吸收，主要水解為相應的β-羥酸，此結構是催化膽固醇合成的早期限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A reductase，HMG-CoA）還原酶的抑制劑。辛伐他汀臨床常用于控制血液中膽固醇的含量以及預防心血管疾病的發生。與相同劑量的洛伐他汀（lovastatin）、普伐他汀（pravastatin）和氟伐他汀（fluvastatin）等其他HMG-CoA還原酶抑制劑相比，辛伐他汀可以更有效地降低血清中的總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-cholesterol）的含量，臨床療效更為顯著。實驗研究發現，辛伐他汀亦具有促細胞成骨分化的功能，為辛伐他汀的臨床應用開辟了新的領域。Mundy等通過熒光素酶標記基因轉染等多種實驗途徑，首次驗證了辛伐他汀的體內及體外促成骨活性。2009年，Okayama等實驗證明辛伐他汀能激活BMP-2的啟動子，誘導BMP-2 mRNA和蛋白的表達，提示其具有刺激骨形成的作用。人牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）可向成骨細胞、神經細胞、脂肪細胞、肌細胞等多種細胞分化，擁有多向分化的潛能，它可以作為一種組織工程的種子細胞。組織工程修復牙體及頜骨缺損一直以來是口腔修復的目標，人牙髓干細胞作為一種組織來源更為接近的種子細胞，口腔科組織工程應用更具優勢。本實驗旨在證明人牙髓干細胞作為種子細胞的可行性，為牙體及頜骨缺損的組織工程修復提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料：胎牛血清（Hyclone，美國）；DMEM F/12（Gibco，美國）培養基；I型膠原酶（Gibco，美國）；胰酶（碧云天生物技術研究所，上海）；青鏈霉素（碧云天生物技術研究所，上海）；PBS緩沖溶液；抗壞血酸（sigma，美國）；β-甘油磷酸鈉（sigma，美國）；L-谷氨酰胺（sigma，美國）；茜素紅（sigma，美國）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）；辛伐他汀（sigma，美國）；Triton X-100（碧云天生物技術研究所，上海）。TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技有限公司，北京）；逆轉錄試劑盒（Bioneer，韓國）；PCR試劑盒（創奇，北京）

1.2 方法

1.2.1 DPSCs分離培養及傳代：選擇哈爾濱醫科大學附屬第二醫院口腔外科門診采集的因正畸拔除的正常前磨牙或阻生的正常第三磨牙（患者14～25歲），所有成年患者及未成年患者家屬均知情同意。依據Gronthos DPSCs原代細胞培養法，劈開實驗牙，用鑷子取出牙髓，含雙抗PBS充分沖洗，置于體積分數為0.3%的I型膠原酶和0.4%的分散酶（1：1）37℃橫濕振蕩器內消化1h，200目尼龍篩過濾懸液至10ml離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，加入含20%FBS培養基，吹打混勻，血球計數板計數以1×10⁸個/L細胞接種至50ml培養瓶，37℃，5%CO₂恒溫培養箱中培養。每周換液兩次，細胞融合達80%后，0.25%胰蛋白酶消化，1：2比例傳代。

1.2.2 DPSCs鑒定

1.2.2.1 細胞形態學鑒定：倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長情況和形態特征。

1.2.2.2 礦化結節鑒定：將第三代人DPSCs以1×10⁵個/孔接種于六孔板中，12h后，各孔換為礦化培養液（DMEM F/12培養基、胎牛血清、青鏈霉素、100μmol/L抗壞血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，2mmol/L L-谷氨酰）繼續培養14天后進行茜素紅染色，培養皿PBS緩沖液沖洗3遍，95%無水乙醇固定15min，蒸餾水沖洗3次，0.1%茜素紅-Tris—HCI（pH=8.3）37℃孵育30min，蒸餾水輕輕沖洗，干燥，照相。

1.2.3 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性測定：將第三代人DPSCs以5×10³個/孔接種在九十六孔板中，12h后，各孔換為礦化培養液繼續培養，細胞培養分A、B、C、D四組，各組辛伐他汀濃度為A組：1×10^-6mol/L；B組：1×10^-7mol/L：C組：1×10^-8mol/L；D組：0 mol/L。每組各10孔，繼續培養3天，去除培養板中培養液，0.01mol/L PBS沖洗細胞3次，加入50μl 0.1%Triton X-100，4℃冰箱過夜，光鏡下觀察已無明顯細胞結構，反復吹打后每個樣本加入ALP緩沖液和基質液各50μl，充分混勻，37℃水浴15min，加入顯色劑150μl，在酶標儀上選擇520nm波長檢測各孔吸光度（A）值，觀察各組細胞ALP活性。

1.2.4 反轉錄聚合酶鏈反應（Reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測骨唾液酸蛋白基因表達：將第三代人DPSCs以1×105個/孔接種于六孔板中，12h后，各孔換為礦化培養液，細胞培養分A、B、C、D四組，各組辛伐他汀濃度為A組：1×10^-6mol/L；B組：1×10^-7mol/L：C組：1×10^-8mol/L；D組：0mol/L。每組樣本量為3，繼續培養7天后進行RT-PCR實驗。依據操作手冊使用Trizol試劑裂解細胞，提取總mRNA。參照RT-PCR逆轉錄試劑盒操作說明書將總mRNA依次按70℃5min、50℃ 1h、95℃5min逆轉錄為cDNA。PCR反應條件為：94℃2min預變性后，94℃ 30s、48.2℃30s、72℃ 30s，35個循環，72℃ 2min延伸，4℃保存。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統分析。以電泳條帶的強度×面積求得基因表達量，將基因表達量除以管家基因表達量求得基因陽性表達水平。RT-PCR引物序列（見表1）。

1.2.5 統計學分析：使用SPSS 15.0統計學軟件，計量資料采用“均值±標準差”形式描述。

對實驗組與對照組檢測結果進行t檢驗和方差分析。

2 實驗結果

2.1 DPSCs光學顯微鏡下細胞形態學變化：DPSCs原代培養24h內細胞貼壁緩慢，可見細胞為梭形，形態較小，未完全伸展，且有少量懸浮未貼壁細胞。48h，細胞梭形，貼壁較多，少量細胞呈克隆團狀生長（見圖1）。7天后可見DPSCs大量擴增，呈伸展長梭形，克隆團狀聚集生長，細胞融合率可達80%（見圖2）。

2.2 礦化結節鑒定：DPSCs 14天培養后，可見部分細胞發生成骨細胞樣多角形以及錐體形態改變。DPSCs在礦化誘導后逐漸產生白色點狀晶體。經茜素紅染色后光學顯微鏡下可見橘紅色礦化結節，呈團狀不規則形態（見圖3）。

2.3 辛伐他汀對DPSCs堿性磷酸酶活性的影響：在礦化誘導條件下，辛伐他汀對人牙髓干細胞ALP活性有促進作用，1×10^-6mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-8mol/L組與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中1×10^-7mol/L組對ALP活性的影響最顯著（見表2）。

2.4 辛伐他汀對DPSCs BSP表達的影響：與對照組比較，各組BSP表達均較高。其中，辛伐他汀濃度為1×10^-7mol/L時，BSP表達量最高（見表3）。

3 討論

多項體內及體外的實驗研究發現，辛伐他汀具有明顯的促進骨形成的作用。2001年，Meada等發表文章，研究辛伐他汀作用下，非轉化成骨樣細胞MC3T3-E1和鼠骨髓細胞的生長情況，發現辛伐他汀提高成骨細胞堿性磷酸酶活性并促進礦化結節形成，此效應呈時間、劑量依賴性。胡飛等研究辛伐他汀對人牙周膜細胞成骨活性的影響，證明適宜濃度辛伐他汀提高了人牙周膜細胞ALP活性和骨橋蛋白的表達，有效促進了人牙周膜細胞的成骨活性。Chan等統計分析表明，服用他汀類藥物可增加股骨頸骨密度，長期服用降低老年婦女發生非病理性骨折的危險性。張曉艷等利用含有β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C的條件培養液，成功誘導人前磨牙牙髓干細胞向成骨細胞樣細胞的分化，充分說明人牙髓干細胞的骨向分化潛能，為人牙髓干細胞的臨床應用提供了理論依據。

ALP是一種分泌型蛋白，它的表達是成骨細胞分化的主要特征之一，是基質成熟的早期標志物。其主要作用是水解胞漿中的有機磷酸釋放出無機磷，促使基質礦化。測定細胞內ALP活性變化作為一種常用的手段用于細胞成骨分化程度和細胞礦化能力的檢測。當成骨細胞進入礦化期，細胞內堿性磷酸酶活性下降，而此時與細胞外基質中羥基磷灰石沉積相關的基因表達達到高峰，如骨橋蛋白、骨鈣素、骨唾液酸蛋白基因。骨唾液酸蛋白由成骨細胞、破骨細胞以及其他一些骨相關細胞合成和分泌，其表達局限于礦化組織中。

本實驗通過ALP試劑盒、RT—PCR法觀察辛伐他汀作用后，人DPSCs礦化能力的改變。結果表明辛伐他汀濃度在1×10^-8mol/L～1×10^-6mol/L范圍內，與對照組比較，ALP活性及BSP基因的表達量均提高，當辛伐他汀濃度為1×10^-7mol/L時，促進作用最明顯，證實辛伐他汀誘導人DPSCs是一種可行、有效的促進成骨活性的方法，與以往的實驗結論相同。但辛伐他汀的有效作用濃度各實驗研究結果不盡相同，可能與細胞種類、培養方法及培養環境相關，還有待進一步的研究。