年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體囊膜中P33ING1的表達

喬淑琴等

摘 要 目的：探討年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生與晶狀體前囊膜中P33ING1表達之間的相關(guān)性。方法：收集30例年齡相關(guān)性白內(nèi)障及10例透明晶狀體前囊膜，采用免疫組織化學(xué)法，分別觀察透明晶體組和白內(nèi)障組晶狀體上皮細胞中P33ING1陽性表達水平。結(jié)果：白內(nèi)障患者晶狀體囊膜中P33ING1含量較正常人明顯增高。結(jié)論：P33ING1在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的形成過程中起重要作用。

關(guān)鍵詞 年齡相關(guān)性白內(nèi)障 晶狀體上皮細胞 P33ING1

白內(nèi)障是世界范圍內(nèi)的首位致盲性眼病。目前，對于它的病因和發(fā)病機制并未完全明了。1995年Li等提出[1]，晶狀體上皮細胞的凋亡是各種非先天性白內(nèi)障共同的細胞學(xué)基礎(chǔ)。P33ING1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種生長抑制基因，具有促進細胞凋亡，抑制細胞生長的作用。目前臨床上關(guān)于P33ING1的研究主要集中在各類惡性腫瘤的診斷和治療方面，針對年齡相關(guān)性白內(nèi)障，P33ING1基因在國內(nèi)外文獻中鮮見報導(dǎo)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測P33ING1基因在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中的表達情況，從蛋白水平初步探討P33ING1基因在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展過程中的作用，從而對年齡相關(guān)性白內(nèi)障的臨床治療及新藥開發(fā)提供可能的手段和新的思路。

資料與方法

2007年9月～2008年1月收治老年性皮質(zhì)性白內(nèi)障患者30例（30只眼），男14例，女16例，年齡60～80歲，平均67.24±5.47歲。入選病例除外高度近視、葡萄膜炎、糖尿病、自身免疫病、神經(jīng)變性疾病、惡性腫瘤患者等影響晶狀體囊膜代謝的局部或全身性疾病。術(shù)前常規(guī)行裂隙燈顯微鏡、角膜曲率、眼科A、B超檢查，術(shù)中采用連續(xù)環(huán)形撕囊，取其中央部晶狀體前囊膜作為白內(nèi)障組。在蘭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼庫中另取10例（10只眼）非正常死亡的透明晶狀體前囊膜作為對照組。兩組晶狀體前囊膜用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，每例標(biāo)本做4μm厚連續(xù)切片，用于免疫組織化學(xué)染色，并做HE染色確定診斷。

主要試劑：鼠抗人P33ING1單克隆抗體（工作濃度25μg/ml），鼠抗人P53單克隆抗體（工作濃度1：200）、S-P試劑盒及DAB染色劑等。

免疫組織化學(xué)染色法檢測蛋白水平的表達：采用免疫組化S-P法，具體操作按說明書進行。每次染色均同步設(shè)陰性和陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照，檢測P33ING1用鼠腦做陽性對照，檢測P53時所用陽性對照為公司提供。

結(jié)果判定：P33ING1蛋白表達陽性細胞均為細胞核呈棕黃色。表達結(jié)果以高倍鏡（×400）下每張切片隨即選擇5個高倍視野，用Image-ProPlus 5.0軟件進行灰度值掃描。

統(tǒng)計學(xué)處理：所有結(jié)果應(yīng)用SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。對結(jié)果采用t檢驗分析。

結(jié) 果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在正常透明晶狀體前囊膜中，P33ING1蛋白極低表達，而在年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體前囊膜中，可見P33ING1蛋白高表達。正常組與白內(nèi)障組P33ING1蛋白表達陽性細胞差異有顯著性。

討 論

細胞凋亡是有核細胞在凋亡信號刺激作用下通過啟 動細胞內(nèi)死亡機制，經(jīng)過一系列信號傳導(dǎo)途徑，最終發(fā)生細胞程序性死亡的過程。1995年Li等首先用Tunel法及DNA電泳法對20例不同類型白內(nèi)障患者的晶狀體上皮細胞進行檢測，并在電鏡和光鏡下發(fā)現(xiàn)了凋亡的晶狀體上皮細胞，相反在8名正常人晶狀體上皮細胞中幾乎無凋亡細胞。同時在H2O2、紫外線、鈣離子載體誘導(dǎo)的白內(nèi)障晶狀體離體實驗中[2]，也發(fā)現(xiàn)了晶狀體上皮細胞中有大量凋亡細胞存在，因此推測晶狀體上皮細胞的凋亡可能是各種非先天性白內(nèi)障發(fā)生的共同細胞學(xué)基礎(chǔ)。ING1基因是1996年Garkavtsev等分離出的一種新基因。它在正常情況下對細胞生長有抑制作用[3]，故命名為生長抑制因子1。ING1mRNA有ING1a，ING1b，ING1c三種變位剪接形式，分別編碼三種不同的蛋白質(zhì)P47ING1a，P33ING1b，P24ING1c，其中P33ING1b目前研究較多，它在幾乎所有的正常組織細胞中核表達，而其胞質(zhì)表達比較受限[4]。Helbing等證實P33ING1b的過表達可促進由“血清饑餓”誘導(dǎo)的細胞凋亡[5]，此外Helbing等還證實P33ING1b可顯著影響c-myc誘導(dǎo)的凋亡效果，并且可能參與以誘導(dǎo)c-myc過表達激活凋亡的效應(yīng)途徑。Scott等指出[6]，紫外線可引起P33ING1b與增殖細胞核抗原（PCNA）結(jié)合。這一復(fù)合物有利于在DNA復(fù)制期對DNA損傷細胞進行修復(fù)，如果不能完成對細胞DNA的修復(fù)，則可促使損傷細胞發(fā)生凋亡。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察正常透明晶狀體上皮細胞與年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞，證實在正常人的透明晶狀體中P33ING1的表達極低，而在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中P33ING1的陽性表達明顯高于正常組，提示在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展過程中，由于各種危險因素（主要為紫外線輻射作用）的存在，可引起晶狀體上皮細胞的氧化損傷，生成大量的自由基，通過多種途徑作用于DNA，導(dǎo)致DNA損傷，引起P33ING1介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)，如不能完成對DNA的修復(fù)，則晶狀體上皮細胞出現(xiàn)凋亡，最終導(dǎo)致晶狀體混濁。

展望未來，針對老年性白內(nèi)障目前最有效的治療方法為手術(shù)治療，但術(shù)后部分患者可發(fā)生后發(fā)性白內(nèi)障，其發(fā)生原因主要為白內(nèi)障術(shù)后殘留的晶狀體上皮細胞的增殖、遷移和纖維化生。雖然YAG激光后囊切開可治療后囊的混濁，但他僅保持中央部的透明，后囊周邊部的混濁可阻礙眼底檢查，進一步限制了對視網(wǎng)膜周邊部某些病變的有效治療。因此，研究年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞中P33ING1的表達情況，可促使人們從基因水平認識其在年齡相關(guān)性白內(nèi)障DNA損傷修復(fù)中的作用。為尋找更為有效的白內(nèi)障治療方法提供新的理論依據(jù)。而進一步研究P33ING1在后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生機制中是否有相關(guān)性，也為白內(nèi)障手術(shù)后降低后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生開辟了一條新的途徑。

參考文獻

1 Li WC，SPector A.Lens ePithelial cell aPoPtosis is an early event in the develoPment of UBV-induced cataract.Free Radic Biol Med，1996，20：301.

2 LiWC，Kuszak JR，Wang GM，Wu ZQ，SPector A.Calcimycin-induced lens ePithelial cell aPoPtosis contributes to cataract formation[J].ExP Eye Tes，1995，61：9.

3 Garkavtsev I，Kazarov A，Riabowol K，et al.SuPPression of the novel growth inhibitor P33ING1 Promotes neoPlastic transformation[J].Nat Genet，1996，14（5）：415-420.

4 Jager D，Stockert E，Chen YT，et al.Cancer2testis antigens and ING1 tumor suPPressor gene Product are breast cancer antigens：Characteriza tion of tissue2sPecific ING1 transcriPts and a homologue gene[J].Can2cer Res，1999，59（20）：6197-6204.

5 Helbing CC，Veillette C，Riabowol K，et al.A novel candidate tumor suPPressor，ING1，is involved in the regulation of aPoPtosis[J].Cancer Res，1997，57（7）：1255-1258.

6 Scott M，Bonnefin P，Vieyra D，et al.UV2induced binding of ING1 to PCNA regulates the induction of aPoPtosis[J].J Cell Sci，2001，114（19）：3455-3462.