刺吸電位技術在植食性盲蝽取食行為研究中的應用

趙旭輝　門興元　周成剛

摘要：刺吸電位技術（electrical penetration graph，簡稱EPG）是昆蟲電生理學發展的技術之一，主要用于研究刺吸式口器昆蟲對寄主植物的取食行為。通過電子轉換，將刺吸式昆蟲取食行為中的不同階段以不同的取食波形顯示出來。本文綜述了刺吸電位技術的發展歷史、工作原理和植食性盲蝽的取食特點以及不同盲蝽取食行為中的EPG波形變化，同時概述了EPG應用中的技術要點。

關鍵詞：EPG；植食性盲蝽；取食行為；EPG波形

中圖分類號：S431.9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）07-0133-05

電信號傳遞是生物體內信息傳遞的主要方式之一^[1]，對電信號的研究衍生出了電生理學。作為昆蟲電生理學研究的常用技術之一，刺吸電位技術（electrical penetration graph， EPG）通過記錄刺吸式口器昆蟲口針在寄主組織中的刺探行為引起的電信號變化特征來對昆蟲口針在寄主組織中的位置進行準確定位，從而對刺吸式昆蟲取食行為的不同階段進行研究。經過不斷的發展，EPG技術已經成為研究刺吸式口器昆蟲對寄主植物的取食選擇性、取食部位蟲傳病毒的機制和作物的抗蟲機制等的重要手段^[2～5]。

EPG技術最先應用于蚜蟲取食行為的研究，此后逐漸應用在粉虱和葉蟬等典型刺吸式昆蟲的取食行為研究中。近年來，由于植食性盲蝽類害蟲的大面積暴發，EPG技術在植食性盲蝽類害蟲取食行為研究中的應用日益增加。在植食性的刺吸類害蟲中，植食性盲蝽類昆蟲屬于細胞取食者，其取食行為特點與蚜蟲和粉虱等汁液取食者有所不同，因而這兩類昆蟲取食行為的EPG波形有一定的差別，在EPG使用中的技術要點上也有一些差異。目前EPG技術在植食性盲蝽取食行為研究中的應用尚有較大空間。

1EPG的發展歷史及其工作原理

1.1EPG的發展歷史

EPG的原型是1964年美國加利福尼亞大學McLean和Kinsey設計的蚜蟲取食監測系統（electrical feeding monitor），并依此建立了蚜蟲的取食和分泌唾液的波形記錄，及豌豆蚜取食刺吸行為與電子記錄波形的對應關系，后來又觀察了溫度對刺吸行為的影響^[6～9]。之后歷經不少學者的努力改進，最終得以發展成熟^[10～16]。到了20世紀80年代中期，EPG技術與計算機聯用，明顯提高了分析效率，之后的絕大多數EPG 的使用逐步建立在波形基礎上，對昆蟲行為生態學進行研究，研究對象也擴展到包括粉虱、葉蟬、薊馬等在內的多種刺吸式昆蟲^[17]。而研究方法也逐步的由單純的EPG系統向著EPG系統與影像監測技術、顯微技術以及熒光技術聯合使用的方向轉化，這無疑會使研究更加細致和深入。

1.2EPG的工作原理

在EPG整個回路中，用水溶性銀膠將一根長2～3 cm、直徑10～20 μm的金線（或鉑金線）的末端粘在昆蟲的前胸背板上^[14]，以此作為昆蟲電極；將一根長約10 cm，直徑約2 mm的銅棒插入到濕潤的土壤中作為植物電極。當刺吸式昆蟲口針插入到植物組織中時，整個回路接通，此時用放大器將回路電流輸出成為一系列的輸出電流波譜，將刺吸式昆蟲的取食過程通過電位的形式記錄下來^{[11～13，18]}。

EPG的電勢波動分為電阻（R）成分和電動勢（emf）成分。前者由電阻變化引起，后者由生物電生理變化引起。當放大器的輸入電壓改變時，極性和幅度會隨之改變的為R成分，保持不變的為emf成分^{[11～13，18]}。如果整個系統的設計是基于交流電路，則稱其為 AC-EPG，即交流電型電子取食監測儀。AC-EPG的R成分和emf 成分的變換都可引起輸出電壓的變化，目前在美國應用較多。若系統用一個不可轉換的沒有矯正器或過濾器的中至高輸入電阻（109～1012 Ω）的放大器或使用干電池則為直流電型電子取食監測儀（DC-EPG）^{[11，19～21]}，目前歐洲應用較多。DC-EPG系統的R成分固定，輸出電壓的變化僅為emf成分，這顯然使輸出的波形更加準確和細致^[17]。

2植食性盲蝽的取食特點

植食性盲蝽為刺吸式口器昆蟲，但此類昆蟲屬于細胞取食者（mesophyll feeder），其取食方式和蚜蟲、粉虱等汁液取食者（vascular feeder）有所不同^[22]。植食性盲蝽主要取食植物細胞的細胞質和細胞核，在取食時先將口針插入植物細胞內或細胞間，然后通過口針的劇烈活動撕碎植物細胞，在破壞細胞的同時分泌唾液，將要取食的食物變成泥漿狀物質之后再進行吸食^[23]。此類昆蟲在吸食了這種泥漿狀的物質后，在取食部位植物組織內留下一個空洞，造成被害植物組織壞死，形成刺點^[24，25]。

3植食性盲蝽取食行為中的EPG波形

EPG應用于盲蝽研究的時間較短，目前使用EPG進行過研究的有豆莢草盲蝽^[26]、中黑盲蝽^[27]以及綠盲蝽^[28，29]。

3.1豆莢草盲蝽取食的 EPG波形探究2002 年Cline和Backus首次利用AC-EPG和錄像設備研究了豆莢草盲蝽在人工飼料上的取食行為，首次對植食性盲蝽類昆蟲的取食行為進行了EPG的研究。他們共對豆莢草盲蝽取食行為中的7種行為進行了EPG波形的定義，并將波形劃分成了8種，分別命名為A波、B波、C1波、C2波、D波、F波、Z1波以及Z2波，之后又首次通過EPG和錄像設備對豆莢草盲蝽的口針刺探穿刺行為和其與刺探行為和非刺探行為相關的外部身體活動進行了統計學分析^[30]。

3.2中黑盲蝽取食的 EPG波形探究蔡曉明等（2008）^[27]用DC-EPG記錄中黑盲蝽雌蟲在菜豆、苜蓿、甘藍、小麥、棉花等寄主上的取食行為，發現不同寄主植物上的取食波形大致相同。整個刺探波呈“～”樣的波浪形，大致可分為4部分：Ⅰ波、Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅳ波。Ⅰ波表示口針的刺入；Ⅱ波表示口針在撕裂植物組織和細胞，并分泌唾液；Ⅲ波表示吸食，有Ⅲ1和Ⅲ2兩種表現形式；Ⅳ波表示口針的拔出。此外中黑盲蝽在菜豆、苜蓿上取食的Ⅱ波中鑲嵌有鋸齒狀K波。

3.3綠盲蝽取食的EPG波形探究對綠盲蝽取食行為的EPG波形定義目前有兩種，如圖1和圖2所示。兩者的研究均以棉花作為寄主植物，但前者是以綠盲蝽4齡若蟲為研究對象，后者是以綠盲蝽成蟲為研究對象。所獲得的波形及其定義均以中黑盲蝽取食的EPG波形作為參照且大致相同。

圖1中所示有綠盲蝽取食的5種波形，稱為NP波、A波、M波、H波和B波。 其中NP 波是綠盲蝽口針停留在葉片表面未進行刺吸行為的波形；A 波是綠盲蝽以很快速度刺入葉片的波形（0.05～0.2 Hz）； H 波是綠盲蝽刺入組織后，在組織內的刺探波形（0.5～1，5～6 Hz）；M 波是口針進入韌皮部中破碎細胞并分泌唾液（0.5～1 Hz）；B波是綠盲蝽在組織內部進行取食，以及取食完畢后口針拔出（0.5～1、2～3 Hz）。

圖2所示綠盲蝽取食行為的EPG波形與中黑盲蝽取食的EPG波形大體上一致，整個取食過程的EPG呈現“～”狀的波浪形并分為Ⅰ波、Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅳ波4個部分。其中Ⅰ波表示綠盲蝽口針開始刺入植物組織；Ⅱ波表示綠盲蝽口針已經刺入植物表皮，在撕裂植物組織或細胞；Ⅲ波表示綠盲蝽在取食細胞內容物；Ⅳ波表示綠盲蝽拔出口針，結束取食。

4EPG應用中的技術要點

4.1實驗材料的選擇

實驗所選植物應長勢良好、莖葉健壯，以盡可能的減少由于實驗材料所導致的誤差，葉片的選定要根據實驗的具體目的來確定。為防止葉片移動造成蟲體脫落，可用斜放的塑膠板或聚酯板固定葉片^[31]。所用昆蟲應選用行動力強的健康昆蟲，蟲齡的選用依據實驗目的來確定，選用成蟲時一般選用剛剛羽化的，若蟲則選用剛完成蛻皮的。

4.2實驗昆蟲的預處理

進行EPG的實驗前一般需要對選用的昆蟲進行固定以方便昆蟲與金絲的粘連，目前常用的固定方法主要有負壓法、冷凍法或CO2麻醉法。負壓固定可采用真空泵或負壓等制作固定昆蟲的裝置，簡單的也可以利用水流產生的負壓。昆蟲的麻醉方法有干冰麻醉法、冷凍法和乙醚麻醉法。目前常用麻醉法與固定法相結合的方式固定昆蟲，其中麻醉法可選用CO2麻醉法，固定法采用真空泵負壓法。

4.3實驗昆蟲與金絲的連接

電極與昆蟲蟲體的連接是一個技術難點^[32]，即金絲表面比較光滑，橫截面較小，很難聚集銀膠，而試蟲的連接需要一定的接觸面積才能保證其牢固性。在實踐中，我們可以在金絲端部制作一個鉤狀結構或者使之形成一個銀膠球的方式解決上述難點^[31]。將金絲端部浸入銀膠中，抽出后讓附著的銀膠在空氣中干燥 1～2 min，再將金絲端部浸入銀膠，如此反復至金絲端部形成一個銀膠球。銀膠球的大小可根據昆蟲個體大小進行選擇。成蟲和大齡若蟲粘連時可先將麻醉過的綠盲蝽腹面用負壓裝置吸住，然后直接進行粘連；低齡若蟲需要在解剖燈下進行粘連的操作。

在將綠盲蝽與金絲粘連成功以后可直接與電極連接并開始記錄，但在分析數據時應該把記錄開始到開始刺探前的這段時間去掉，因為先后連接金絲的昆蟲所受的干擾時間和程度不同，可能使得在記錄植物上的刺探開始前的適應期不同。有學者認為在連好金絲后需要先將昆蟲進行饑餓或適應處理。

4.4記錄過程中的問題

EPG 對外界干擾十分敏感，外界電波的干擾會影響記錄的信號，所以整個實驗裝置應置于一個電壓比較穩定、免除外界干擾的環境中，DC-EPG 必須使用接地的法拉第籠來屏蔽噪音^[33]。在每次實驗前，先要對 EPG 系統和放大系數進行調校。植物電壓的調校不當會造成只有正的波形或者只有負的波形被記錄的情況； 而放大系數的調校不當會造成有些有意義的波形不能明確顯示^[34]。放大系數為 50 倍比較適宜。

EPG 實驗記錄時間的長短主要取決于實驗目的。一般昆蟲與植物關系的研究需要記錄 6 h。而研究昆蟲傳毒機制，記錄幾分鐘就可以了。若研究寄主植物表面或葉肉層次物理化學性質對昆蟲取食行為的影響，一般記錄30 min～3 h 。

另外需要在記錄時采用EPG通道隨機排列以及多重復的方法來盡可能的消除誤差。

5展望

盡管EPG技術經過不斷的發展已經比較成熟，但目前研究較為深入的主要是一些汁液取食類的刺吸式昆蟲如蚜蟲、粉虱等。對植食性盲蝽等細胞取食者的研究仍然不甚深入，現作出定義的一些盲蝽類昆蟲取食波形都是針對的一些較為籠統的行為意義；對盲蝽取食波形的劃分還不夠細致，且沒有經過驗證；對一些不規范波形如突然超出量程的情況尚未發現出現原因及其行為學意義，這還需要進行更加細致的研究；同時在實驗過程當中的一些操作技術需要進一步的規范。鑒于近年來植食性盲蝽對果樹的危害日益嚴重，EPG技術用于果樹危害研究的可能性也需要進行探究。

參考文獻：

[1]王學臣，任海云，婁成后.干旱脅迫下植物根與地上部間的信息傳遞[J].植物生理學通訊，1992，28（6）：397-402.

[2]Woodford J A T， Nisbet A J， Strang R H C， et al. Systemic antifeedant effects of azadirachtin on aphids[A]. In：Peters D C， Webster J A， Chlouber C S（eds.） . Proceedings of the symposium on aphid-plant interactions： populations to molecules， stillwater， ok[M].Oklahoma State Univ.， Div.， Agriculture Publication，1990，350.

[3]Nisbet A J， Woodford J A T， Strang R H C. The effect of azadirachtin on feeding by Myzus persicae[A]. In：Menken S B， Visser J H， Harrewijn P （eds.）. Proceedings of 8th international symposium on insect-plant relationships[M].Wageningen， The Netherlands.Kluwer， Dordrechs， The Netherlands，1992，179-180.

[4]Rahbe Y， Febvay G， Delobel B，et al. Amino acids and proteins as cues in interactions of aphids（ Homoptera： Aphididate） and plant[A]. In：Walker G P，Backus E A （eds.）. Principles and applications of electronic monitoring and other techniques in the study of Homopteran feeding behavior[M]. Thomas Say Publications in Entomology， Entomology Soc.Am.， Lanham.，2000，212-236.

[5]Mauck K E，De Moraes C M，Mescher M C. Deceptive chemical signals induced by a plant virus attract insect vectors to inferior hosts[J].Proceedings of the National Academy of Sciences， 2010，7（8） ：3600-3605.

[6]McLean D L， Kinsey M G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation[J]. Nature， 1964，202：1358-1359.

[7]McLean D L， Kinsey M G. Identification of electrically recorded curve patterns associated with aphid salivation and ingestion[J].Nature， 1965，205（976）：1130-1131.

[8]McLean D L， Kinsey M G. Probing behaviour of the pea aphid，Acyrthosiphon pisumⅠ. Definitive correlation of electronically recorded waveforms with aphid probing activities[J].Annals of the Entomological Society of America， 1967，60（2）：400-406.

[9]McLean D L， Kinsey M G. Probing behaviour of the pea aphid， Acyrthosiphon pisum Ⅲ. Effect of temperature differences on certain probing activities[J].Annals of the Entomological Society of America.1968，61（4）：927-933.

[10]姜永幸，郭予元. EPG技術在刺吸式昆蟲取食行為研究中的應用[J].植物保護，1994，20（2）：33-35.

[11]Tjallingii W F. Electronic recording of penetration behavior by aphids[J].Entomologia Experimentalis et Applicata，1978，24（3）： 721-730.

[12]Tjallingii W F. Electrical nature of record signals during styled penetration by aphids[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata， 1985a，38： 177-186.

[13]Tjallingii W F. Membrance potentials as an indication for plant cell penetration by aphids stylets[J].Entomologia Experimentalis et Applicata， 1985b，38： 187-193.

[14]Tjallingii W F. Wire effects on aphids during electrical recording of stylet penetration[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata， 1986，40（1）： 89-98.

[15]McLean D L， Weigt W A. An electronic measuring system to record aphid salivation and ingestion[J].Annals of the Entomological Society of America， 1968，61（1）： 180-185.

[16]Prado E， Tjallingii W F. Aphid activities during sieve element punctures[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata， 1994，72（2）：157-165.

[17]羅晨，岳梅，徐洪富，等.EPG技術在昆蟲學研究中的應用及進展[J].昆蟲學報，2005，48（3）：437-433.

[18]Tjallingii W F. Electrical recording of stylet penetration activities[A]. In：Minks A K， Harrewjjn P（eds.） . Aphids， their biology， natural enemies and control[M]. Amsterdam： Elsevier，1987， 95-108.

[19]Schaefers G A.The use of direct current for electronically recording aphid feeding and salivation[J].Annals of the Entomological Society of America， 1966，59（5）： 1022-1024.

[20]Backus E A， Bennet W H. A new AC electronic insect feeding monitor for fine structure analysis of waveforms[J].Annals of the Entomological Society of America， 2009，85（4）： 437-444.

[21]Khan Z R. Electronic device to record feeding behavior of white backed planthopper on susceptible and resistant rice varieties[J].Journal of Economic Entomology， 1984，9（1）： 8-9.

[22]Labandeira C C， Phillips T L. Insect fluid-feeding on upper Pennsylvanian tree fern （Palaeodictyoptera，Marattiales） and the early history of the piercing-and-sucking functional feeding group[J].Annals of the Entomological Society of America，1996，89（2）：157-183.

[23]Rodriguez-Saona C， Crafts-Brandner S J， Williams L，et al. Lygus hesperus feeding and salivary gland extracts induce volatile emissions in plants[J].Journal of Chemical Ecology，2002，28（9）：1733-1747.

[24]Shackel K A， Celorio-Mancera M P， Ahmadi H，et al.Micro-injection of Lygus salicary gland proteins to simulate feeding damage in alfalfa and cotton flowers[J].Archives of Insect Biochemistry and Physiology，2005，58（2）：69-83.

[25]Kimmins F M， Tjallingii W F. Ultrastucture of sieve element penetration by aphid stylets during electrical recording[J].Entomologia Experimentalis et Applicata，1985，39（2）：135-141.

[26]Cline A R， Backus E A. Correlations among AC electronic monitoring waveforms， body postures， and stylet penetration behaviors of Lygus hesperus （Hemiptera：Miridae）[J].Environmental Entomology， 2002， 31（3）： 538-549.

[27]蔡曉明，吳孔明，原國輝.中黑盲蝽在幾種寄主植物上取食行為的比較研究[J].中國農業科學，2008，41（2）：431-436.

[28]趙秋劍，吳敵，林鳳敏，等.綠盲蝽在不同棉花品（系）上取食行為的EPG解析及田間驗證[J].中國農業科學，2011，44（11）：2260-2268.

[29]雒珺瑜，崔金杰，辛惠江.綠盲蝽在棉花上取食行為的刺探電位分析[J].中國棉花，2011，5：25-26.

[30]Backus E A， Cline A R， Ellerseick M R，et al. Lygus hesperus （Hemiptera： Miridae） feeding on cotton new methods and parameters for analysis of nonsequential electrical penetration graph data[J].Annals of the Entomological Society of America， 2007，100（2）：296-310.

[31]湯清波，張大山，姬琨，等.刺吸電位技術應用中的幾個問題[J].應用昆蟲學報，2011，48（5） ：1519-1527.

[32]岳梅，羅晨，徐洪富，等. 刺吸電波實驗中金絲與煙粉虱的粘連技術[J].昆蟲知識，2005，42（3）：326-328.

[33]Jiang Y X， Walker G P. Identification of phloem sieve elements as the site of resistance to silverleaf whitefly in resistant alfalfa genotypes[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata， 2007， 125（3）：307-320.

[34]Jiang Y X， Nombela G. Analysis by DC-EPG of the resistance to Bemisia tabaci on an Mi-tomato line Muiz[J].Entomologia Experimentalis et Applicata， 2001， 99（3）：295-302.