核桃GAI基因的克隆和序列分析

徐麗等

摘要：DELLA蛋白是赤霉素信號傳導通路中一類重要的負調節因子。利用RT-PCR技術以香玲核桃葉片為試材，克隆得到核桃DELLA蛋白基因JrGAI。對基因和編碼蛋白序列進行分析，結果表明，JrGAI基因開放閱讀框（ORF）為1 837 bp，編碼612個氨基酸；生物信息學分析表明，JrGAI編碼蛋白具有DELLA蛋白的典型結構域；利用BLASTx和DNAMAN軟件進行相似性分析發現JrGAI編碼蛋白氨基酸序列與其它植物的DELLA蛋白具有較高的同源性，其中與遼寧2號核桃同源性最高，達到99%。核桃JrGAI基因的克隆為其進一步研究應用奠定了基礎。

關鍵詞：核桃；DELLA蛋白；JrGAI基因；序列分析

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）07-0001-05

赤霉素（Gibberellins，GAs）是一類重要的生長激素，能夠調控植物種子萌發、莖稈伸長、花器官分化以及果實成熟等各個方面^[1]，DELLA蛋白是GA信號傳導通路上一個關鍵的生長負調節因子。DELLA蛋白屬于GRAS（GAI，RGA，SCR）蛋白家族，實驗表明，DELLA蛋白能阻遏植物生長發育，GA通過作用于DELLA蛋白促使其降解，從而促進植物生長^[2～4]。模式植物擬南芥中有5個DELLA蛋白，分別是GAI、RGA、RGL1、RGL2、RGL3^[5～7]。此外，玉米的D8、大麥的SLN1、水稻的SLR1和OsGAI、小麥的RTH1和葡萄的L1等基因的編碼產物也都屬于DELLA蛋白家族^[8～13]。目前有研究表明含DELLA蛋白結構域的GAI基因發生突變，植株多表現出對GA不敏感的矮化特征，開花延遲^{[8， 14， 15]}。

核桃（Juglans regia L.）是我國重要的干果樹種，在我國有著悠久的栽培歷史和廣泛的地理分布^[16]。目前核桃栽培多采用喬化密植栽培方式，導致樹體高大、樹冠郁閉、管理不便、影響通風透光，以致果實品質差、經濟效益低。矮化密植栽培具有提早結果、管理方便、果實品質好等優點。但是，采用人工雜交選育矮化新品種，往往需要10～20年的時間，周期長、見效慢，如果將赤霉素信號傳導負向調節因子DELLA蛋白基因導入核桃品種，使其株高降低，將有望培育出性狀優良并適于矮化密植的新品種，對核桃生產具有非常重要的現實意義。

本研究從香玲核桃葉片中克隆得到包含ORF全長的DELLA蛋白基因JrGAI，為進一步研究DELLA蛋白功能并為核桃矮化品種的選育工作奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試核桃品種為香玲，香玲核桃組培苗保存在山東省果樹研究所國家核桃板栗資源圃。取生長一個月的核桃組培苗葉片，液氮速凍后保存于-80℃冰箱。

T4 DNA連接酶、pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶均為TaKaRa公司產品；大腸桿菌DH5α、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為TIANGEN產品；其它試劑均為國產分析純。

1.2核桃總RNA提取及RT-PCR

采用北京天根TIAN GEN RNA plant plus Reagent提取葉片總RNA，用DNaseⅠ（TaKaRa）消化去除RNA中的DNA。參照Fermentas公司說明書，以Oligo（dT）18為引物反轉錄合成cDNA第1鏈。

1.3JrGAI基因的克隆

根據GenBank上發表的核桃DELLA蛋白基因序列（登錄號：JF766606.2），在基因兩端設計一對特異引物，上游引物P1：5′-CGGACCCTTTGGGAAACTCT-3′和下游引物P2：5′-ATGGAGGAGACAGGGACTTG-3′。以獲得的反轉錄cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，連接pMD18-T載體，轉化E.coli DH5α，篩選陽性克隆，菌落PCR鑒定后由上海生工生物工程有限公司測序。

1.4JrGAI基因序列分析和同源性比較

利用DNAMAN軟件分析JrGAI基因ORF，推導相應的氨基酸序列，并構建系統進化樹；用NCBI（http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTx和BLASTn進行序列相似性分析；用ProtParam （http： //us.expasy.org/tools/ProtParam.html） 預測編碼蛋白的氨基酸序列組成、分子量、等電點等理化特性；通過ProtScale軟件（http：//www.expasy.org/cgibin/protscale.pl）進行疏水性/親水性分析；用NCBI CD-Search service工具對JrGAI編碼蛋白的結構域進行分析。

2結果與分析

2.1JrGAI基因的克隆及同源性分析

進行PCR擴增，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在1 900 bp處出現特異性條帶，片段大小與預測值基本一致（圖1），將其命名為JrGAI。將測序結果在NCBI上進行BLASTx比對，其編碼的氨基酸與其它物種的DELLA蛋白具有較高的相似性，其中與遼寧2號核桃（AEE69074.2）相似性最高，達到99%，與毛果楊（XP_002314799.1）、葡萄（AEK06229.1）和蘋果（AAY56751.1）的同源性均達到70%以上。

2.2JrGAI基因序列分析

用DNAMAN軟件分析表明，該基因序列包含1個1 837 bp的完整開放閱讀框，編碼一條由612個氨基酸殘基組成的多肽。用ProtParam軟件預測JrGAI基因編碼蛋白的相對分子質量為66.66 ku；理論等電點（PI）為5.15；帶負電荷的氨基酸殘基數（Asp+Glu）為73，帶正電荷的氨基酸殘基數（Arg+Lys）為49；蛋白質不穩定系數估算為45.41，為不穩定蛋白質；理論推導半衰期大約為30 h；親水性平均數為-0.224，預測該蛋白為親水性蛋白。通過ProtScale軟件對蛋白質整體分析顯示，親水性氨基酸均勻分布在整個多肽鏈中，沒有明顯的疏水性區域，推測JrGAI編碼蛋白是一個親水性蛋白，與ProtParam軟件預測結果一致。利用NCBI CD-Search service 工具對JrGAI編碼蛋白的結構域進行分析表明，該序列N端氨基酸區域和C端氨基酸區域分別含有DELLA超級家族核心序列和GRAS超級家族核心序列（圖2）。

2.3JrGAI編碼蛋白序列分析及系統進化樹的構建

利用DNAMAN軟件比較DELLA蛋白氨基酸同源性，結果表明JrGAI編碼蛋白與數據庫中不同物種的DELLA蛋白具有較高的同源性，都具有GRAS家族所有的典型結構域：N末端具有DELLA和TVHYNP結構域，C末端具有RVER和SAW保守結構域，以及中心區的VHVID、核定位區域（NLS）RKVATYFGLARR、起調節作用的LZ區域和poly S/T/V區域（圖3）。

分析核桃DELLA蛋白系統發育樹（圖 4）發現，十字花科的蕪菁、甘藍和擬南芥聚為一組；薔薇科的蘋果和湖北海棠聚為一組；豆科的菜豆和大豆聚為一組；葡萄科的葡萄和五葉地錦聚到一組；楊柳科的毛果楊與胡桃科的核桃因同屬于分類學上的原始類群在聚類分析結果中關系較近。DELLA蛋白在這些物種之間的進化關系與這些物種在植物形態分類學上的地位一致，這充分顯示了DELLA蛋白在物種進化上的保守性。

3討論

DELLA蛋白定位于細胞核中，是一類GRAS家族蛋白，N末端同源性總體上不高，但存在著DELLA和TVHYNP兩個非常保守的酸性結構域，后面為亮氨酸重復序列LZ，中部有一個核定位信號結構域（NLS），其后有一個保守氨基酸結構域VHVID，在C端有RVER和SAW結構域。有研究表明DELLA和TVHYNP結構域是GA的信號感知區；VHVID、SAW等結構域發揮阻遏作用；NLS結構域是轉錄因子的標志之一，含有NLS結構域的蛋白可以從細胞質定位到細胞核；LZ是二聚化結構域^{[5，17，18]}。DELLA蛋白基因已在不同的物種中被廣泛鑒定，其功能也得以進一步研究^{[8，11，19]}。Foster等^[20]克隆了蘋果DELLA蛋白家族6個基因，其中MdRGL2a與擬南芥GAI同源性為60%，將MdRGL2a轉入擬南芥進行超表達，轉基因植株表現出植株矮化、葉片緊縮、節間變短、開花延遲等特征，類似于擬南芥GAI矮化突變體的表型特征^[21]。將擬南芥中的GAI基因導入水稻進行表達， 可以引起水稻的矮化；在給定GA劑量條件下， 將缺失程度不同的GAI基因在水稻中表達， 可產生矮化程度不同的表型以及對GA不同程度的敏感性^[14]。以上研究表明DELLA蛋白功能較為保守，可引起植物的矮化。

本研究利用RT-PCR技術從核桃中克隆了DELLA蛋白基因JrGAI的ORF全長，通過氨基酸序列比對發現JrGAI編碼的蛋白與其它物種的DELLA蛋白在保守區域上高度一致，具有GRAS家族蛋白的特有結構域，由此推測JrGAI編碼一個DELLA蛋白，并有可能參與核桃GA信號傳導。GA能調控植物莖的伸長，從而決定植物的高度，因此，通過改變植物體內GA的濃度或者對GA的敏感性都可能改變植物的高度，獲得矮化植株。GAI是GA信號傳導過程的負調控因子，過量表達可導致植株矮化，表達量的高低與植株的高度呈負相關，因此，利用基因工程可以定向改變植物的高度。下一步將獲得的JrGAI基因進行轉化，以期得到理想的矮化植株，并對JrGAI基因的功能進行驗證，該方面的研究具有一定的實際應用價值。

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