補腎中藥誘導骨髓基質干細胞成骨分化的動物實驗研究

余可和 余洋　周一飛　毛誠晃　周望者

[摘要] 目的 通過動物實驗于體外條件下觀察補腎中藥對大鼠骨髓基質干細胞增殖分化的影響。 方法 將不同濃度的補腎中藥方劑與骨髓基質干細胞體外共同培養，測定細胞增殖功能，檢測成骨細胞增殖與分化指標（包括堿性磷酸酶、礦化結節）。 結果 與空白組比較，濃度100 mg/L、200 mg/L的補腎中藥在不同時間段均可提高骨髓基質干細胞增殖率（P < 0.05）；與空白組比較，濃度20 mg/L、40 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的補腎中藥可使ALP活性增強、礦化結節數量增多（P < 0.05）。 結論 較高濃度的補腎中藥能促進骨髓基質干細胞的成骨潛能。

[關鍵詞] 補腎中藥；骨髓基質干細胞；堿性磷酸酶；礦化結節

[中圖分類號] R274 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）08-0001-03

骨質疏松癥是中老年人最常見的慢性病之一，其特征主要表現為骨的微觀結構退化、骨量減少。中醫學認為骨質疏松癥發生的重要原因是腎氣虛衰，補腎中藥方劑是治療骨質疏松癥較為有效的藥方。目前在補腎中藥促進成骨的基礎研究方面取得了一些成果[1]，但是目前有關補腎中藥復方的研究仍在探索階段。本實驗自擬對成骨有作用的補腎中藥進行組合， 對體外培養的大鼠骨髓基質干細胞進行誘導，從細胞水平檢測補腎復方對骨髓基質干細胞的影響，觀察成骨情況。

1 材料與方法

1.1 動物

選用出生6周齡雄性SD大鼠，體重不限，購于溫州醫學院實驗動物中心，合格證書：SCXK（浙）2006-0026。

1.2 中藥藥材

藥材（淫羊霍、杜仲、骨碎補、補骨脂、黨參、熟地、川牛膝、云苓、白術、煅龍骨、炒山藥、生蠣、丹皮）購自浙江溫州地區醫藥公司。

1.3 儀器與試劑

Thermo二氧化碳培養箱；Nikon 倒置生物顯微鏡；掃描電鏡，上海泰思肯貿易有限公司；RPMI-1640培養基、胰蛋白酶、MTT試劑、地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉、四環素鹽酸鹽， 均為Sigma 公司產品；胎牛血清，上海勁馬生物科技有限公司；堿性磷酸酶試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.4 方法

1.4.1 補腎中藥水提取液的制備 取淫羊霍、杜仲、骨碎補、補骨脂、黨參、熟地、川牛膝、云苓、白術、煅龍骨、炒山藥、生蠣、丹皮，按比例稱重混合后，加蒸餾水浸泡并煮沸3次，每次3 h，合并濾液并濃縮，用75%乙醇沉淀后靜置于冰箱過夜，次日過濾回收乙醇，用0.5%NaOH調pH至7.0，制成含生藥1 g/mL的藥液，冷藏備用。

1.4.2 大鼠骨髓基質干細胞的分離與培養鑒定[2] 取出生6周左右的雄性SD大鼠，體重不限（由溫州醫學院實驗動物中心提供）。頸椎脫位法處死，無菌條件下取股骨，剪斷兩骨端，無血清培養液吹打髓腔并沖出骨髓。將組織均勻平鋪加10%DMEM培養基接種于10 cm培養皿內，放置于5%CO2、37℃培養箱培養。3 d換液1次，待細胞長滿瓶底時后傳代，利用第3代細胞進行實驗。倒置顯微鏡下觀察細胞形態并用鈣鈷法進行堿性磷酸酶染色。

1.4.3 細胞增殖功能測定 采用MTT法[3]測定補腎中藥方劑對大鼠成骨細胞增殖的影響。細胞消化傳代后，調整細胞濃度加入96孔細胞培養板中，每孔加入培養液，放入5% CO2 37℃培養箱內培養。24 h后顯微鏡下觀察細胞生長合適后，分別換入含1 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、100 mg/L、200 mg/L補腎中藥的DMEM培養基，共6組，每組12孔；對照為空白組，為單用20ng/mL的地塞米松。含不同濃度補腎方劑培養1、3、7、10 d。采用MTT法于490 nm波長，在酶標儀上測試各孔光吸收值。本檢測方法重復3次，分別計算對照組與實驗組的增殖率。

1.4.4 細胞功能的表達 大鼠骨髓基質干以每孔1×105個/孔的密度被接種于6孔培養板，加入培養液，3 d后分別換入含0 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、100 mg/L、200 mg/L補腎中藥的DMEM培養基，定期更換培養液及干預藥物，不進行傳代直至檢測。

①細胞分化功能測定（ALP活性測定） 分別取各組（藥液濃度分別為0 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、100 mg/L、200 mg/L，共7組）培養至第7天的成骨細胞，倒除原培養液，經胰蛋白酶消化后吸出消化液，加入0.9%NaCl吹打后低溫凍溶至破碎，離心后上清液行酶免法測定堿性磷酸酶含量。②細胞礦化功能測定 同上述方法培養至第14天，利用von Kossa染色法顯示礦化結節。培養14 d后采用多聚甲醛進行固定。以直徑>200 μm邊界清晰的結節，為礦化結節的計數標準[1]。

1.5 統計學方法

采用SPSS16.0軟件處理，數據以（x±s）表示，多組間采用方差分析，然后行兩兩t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成骨細胞的鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，培養1 d后大部分的細胞為圓形，大小不等漂浮于培養液；培養2 d后部分細胞貼壁，形態主要為梭形、多角形或紡錘形等幾種形狀（圖1）。培養后7 d貼壁細胞增多可見偽足，瓶底長滿梭形或多角形細胞（圖2）；10 d可見貼壁細胞形多呈梭形（圖3）。von Kossa染色礦化結節（圖4）。

2.2 補腎中藥方劑對大鼠MSCs增殖的影響

如表1所示，在1 d時100 mg/組高于空白組（t = 6.21，P < 0.001），且200 mg/組也高于空白組（t = 10.27，P < 0.001），差異有統計學意義（P < 0.05）；在3 d時濃度為20 mg/L（t = 6.89，P < 0.001）、40 mg/L（t = 6.63，P < 0.001）、100 mg/L（t = 14.49，P < 0.001）、200 mg/L（t = 22.21，P < 0.001）的OD值均高于空白組，差異有統計學意義（P < 0.05）；在7 d時濃度為20 mg/L（t = 15.39，P < 0.001）、40 mg/L（t = 24.36，P < 0.001）、100 mg/L（t = 32.84，P < 0.001）、200 mg/L（t = 29.80，P < 0.001） 的OD值均高于空白組，差異有統計學意義（P <0.05）；在10 d時濃度為20 mg/L（t = 38.80，P < 0.001）、40 mg/L（t = 45.13，P < 0.001）、100 mg/L（t = 37.79，P < 0.001）、200 mg/L（t = 49.71，P < 0.001）的OD值均高于空白組，差異有統計學意義（P < 0.05）。隨著濃度的增高，補腎中藥方劑對大鼠MSCs增殖的影響有促進作用。

2.3 對礦化結節數的影響

如表2所示，選取第14天，濃度20 mg/L組、40 mg/L組、100 mg/組、200 mg/組的礦化結節數與空白組比較，差異均具有統計學意義（P <0.05）。說明隨著補腎中藥濃度的提高，其促進成骨作用逐步增強。

3 討論

骨髓間充質干細胞是存在于骨髓中的間充質干細胞，它具有多向分化潛能，能夠自我更新，可在體外培養。骨髓間充質干細胞在一定的誘導條件下可以向軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、心肌細胞等多個方向分化[4]。成骨細胞是體內骨形成的主要細胞也是骨代謝的重要功能細胞，對維持骨的代謝平衡非常重要[5]。成骨細胞功能障礙或數量減少，都會導致骨組織代謝異常、骨質疏松等多種疾病的發生。骨質疏松癥在中醫學上被認為是腎氣虛衰所致，因此近年來越來越多的研究利用補腎中藥來治療骨質疏松癥。

本研究發現，不同濃度組的補腎中藥均可促進骨髓間充質干細胞的增殖， 增強堿性磷酸酶的活性。堿性磷酸酶是骨髓間充質干細胞成骨分化的主要特征性酶，也是最早出現的指標，其由成骨細胞產生并可反映分化程度的高低。目前比較普遍的觀點認為，堿性磷酸酶在體外的鈣化中起著關鍵的作用[6]，堿性磷酸酶活性的高表達標志著成骨細胞的分化成熟[7]。相較于堿性磷酸酶，礦化結節為骨形成的標志，它的形成代表了細胞進一步成骨分化成熟[8]。本實驗結果顯示，不同濃度的補腎中藥在不同程度上能刺激骨髓間充質干細胞的增殖分化成骨。

傳統醫學認為“腎主藏精”，腎精可以生骨養髓的。本方劑所涵蓋的多味補腎中藥中部分作為單味中藥在體外有促進向骨髓基質干細胞成骨分化的作用。殷曉雪等[9]的研究發現淫羊藿可以上調BMP-2基因的表達，促進成骨細胞的增殖和分化。徐展望等[10]的研究發現補骨脂能促進大鼠成骨細胞的增殖。張立等[11]的研究發現杜仲也能通過刺激成骨細胞的增殖分化促進骨的重建。此外，Wang等[12]的研究指出骨碎補能促進人成骨細胞增殖作用。本實驗中的補腎中藥是在上述單味補腎藥物的基礎上經過組合構成，它能夠促進大鼠體外骨髓間充質干細胞增殖及其向成骨細胞分化。

通過本實驗可以發現，補腎中藥對骨髓基質干細胞增值的影響。在低濃度不但沒有毒害作用，而且隨著濃度的增加，細胞增值作用遞增。中藥具有誘導分化的作用，和空白組相比（空白組也加入了誘導成骨液），中藥有誘導基質干細胞向成骨細胞分化的作用。中期的ALP和細胞分化成熟晚期的礦化結節表明，藥物對細胞的分化成熟作用明顯，特別是對成骨晚期的骨礦化，補腎中藥顯示出極佳的促成骨作用。

[參考文獻]

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[3] 張榮華，舒曉春. 中藥復方補腎活血液對成骨細胞影響的實驗研究[J]. 中國病理生理雜志，2003，19（6）：769-772.

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[9] 殷曉雪，陳仲強，黨耕町，等. 淫羊藿苷對人成骨細胞增殖與分化的影響[J]. 中國中藥雜志，2005，30（4）：289-291.

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[12] Wang XL，Wang NL，Zhang Y，et al. Effects of eleven flavonoids from the osteoprotective fraction of Drynaria fortunei（Kunze） J. Sm. on osteoblastic proliferation using an osteoblast-like cells line[J]. Chem Pharm Bull（Tokyo），2008，56（1）：46-51.

（收稿日期：2013-01-10）