花生CEM1基因的克隆及表達載體構建

張廷婷等

摘要：通過規模測序和生物信息學分析，從花生莢果不同發育時期全長cDNA文庫中篩選出MADS-box家族的一個cDNA全長序列，命名為CEM1基因（GenBank登錄號為EY396043）。該基因全長1 061 bp，包含762 bp的開放閱讀框，編碼253個氨基酸，蛋白質的分子量為29405 ku，等電點（pI）為918。蛋白質信號肽分析和疏水性分析表明，該基因編碼的蛋白質信號肽剪切的可能性很小，具有親水性。同時構建CEM1基因的VIGS表達載體，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。

關鍵詞：花生；莢果發育；CEM1基因；生物信息學；載體構建

中圖分類號：Q785：S565.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）08-0009-06

MADS-box的名稱來自釀酒酵母轉錄因子MCM1、擬南芥花同源異型基因蛋白AGAMOUS、金魚草花同源異型基因蛋白DEFICIENS和人血清應答因子SRF 4種蛋白的首字母，這4種蛋白質都有一個由56～58個氨基酸組成的高度保守的MADS盒，編碼含有這種保守序列蛋白因子的基因稱為MADS-box基因。病毒誘導的基因沉默（Virus-induced gene silencing， VIGS）是近年來發現的一種轉錄后基因沉默現象，可以引起內源mRNA序列特異性降解_[1，2]，即如果在病毒載體中加入目的基因片段，侵染寄主植物后，植物會表現出目的基因功能喪失或者表達水平下降的表型，從而確定基因功能。其作用機制為：含有目的基因片段的病毒載體在被侵染的植物組織中大量復制，病毒載體中的目的片段在RNA引導的RNA聚合酶作用下合成大量的雙鏈RNA（Double-stranded RNA， dsRNA）；dsRNA在Dicer酶的作用下產生21～25個核苷酸的短干擾RNA（Small interfering RNA， siRNA）；然后，siRNA的反義鏈和RNA誘導的基因沉默復合物（RNA-induced silencing complex， RISC）結合，特異性識別細胞質中目的基因的單鏈mRNA，造成目的基因mRNA的特異性降解，從而導致目的基因在RNA水平上的沉默_[3～5]。本試驗克隆了花生MADS-box基因，對其及編碼的蛋白進行生物信息學分析，并構建了VIGS表達載體，為轉基因奠定基礎，這對花生分子育種實踐以及闡明果實與種子發育相關的遺傳和生理現象具有重要意義。

1材料與方法11試驗材料

1.1.1植物材料本研究所用材料為花生品種閩花6號。

1.1.2試劑與儀器本研究所用逆轉錄酶、DNA酶、Ex Taq酶 、RNA酶抑制劑、內切酶NcoⅠ和PstⅠ、dNTPs等購自大連寶生物公司；DNA膠回收試劑盒購自北京博大泰克公司；質粒提取試劑盒購自北京博大泰克公司；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；其它化學試劑為國產分析純。

Biometra PCR儀購自華粵行儀器有限公司；UV-2800/2802/2802S型紫外可見分光光度計購自尤尼柯（上海）儀器有限公司；UV-2000系列紫外分析儀購自天能科技（上海）有限公司。

2結果與分析

2.1花生CEM1基因的克隆

通過全長cDNA文庫篩選和EST測序得到了該基因的EST序列，其克隆號為2P7，命名為CEM1， GenBank登錄號為EY396043。雙向測序結果表明CEM1全長1 061 bp，包含一個762 bp的ORF，編碼253個氨基酸（圖1），相對分子量為29405 ku，理論等電點（pI）為918。將該基因序列在NCBI中進行Blast比較，結果與豌豆已知基因（GenBank 登陸號為AAX69070）的同源性為79%；將推導的氨基酸序列在蛋白數據庫里進行Blast分析，結果與一個花生MADS-box基因氨基酸序列同源性為84%，由此確認CEM1是花生MADS-box基因。

2.2CEM1蛋白序列分析

將推導的CEM1氨基酸序列與其它10個物種來源的MADS-box氨基酸序列進行比對并構建系統進化樹。序列比對結果顯示CEM1與大豆的AGL1（GI：358248235）序列比較一致，與苜蓿等其它來源的氨基酸序列也存在一定的同源性（圖2）。系統進化樹結果顯示CEM1與大豆AGL1親緣關系較近（圖3）。

2.3CEM1蛋白的結構域、信號肽與疏水性分析

將推導的CEM1氨基酸序列進行保守區域分析，發現該序列有兩個保守結構域：MADS_MEF2_like功能域和K-box結構域（圖4）。具有MADS-box蛋白的典型結構。

3討論

MADS-box是一類數量龐大的基因家族，其編碼的蛋白是一類轉錄因子，具有高度保守的MADS-box 結構域和半保守的能形成卷曲螺旋的K區_[6]。MADS-box基因又分為3個主要類群，即ARG80基因家族、MEF2基因家族以及MIKC基因家族_[7]。植物基因組含有大量的MADS-box基因，它在植物的發育過程尤其是生殖發育過程中起著廣泛的調節作用_[8]，其主要功能是調控植物花的發育和果實的成熟。但也有研究顯示MADS-box調控著其它器官的發育，如Buchner等發現一個MADS-box基因在豌豆種皮中表達_[9]。關于花生MADS-box基因及其對胚胎和種子發育過程調節作用的研究還未見報道。本研究克隆得到花生CEM1基因，經生物信息學分析，確認為花生MADS-box家族的一員，并構建了VIGS表達載體，對于利用遺傳操作技術如轉基因等培育優良的作物品種_{[10，11，12]}、解釋植物生長發育理論和闡明相關的遺傳和生理現象等具有重要意義。

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