乳腺癌生物標(biāo)志物CK19、HER2和血清CEA、CA153聯(lián)合檢測(cè)的臨床意義

孫昕??李嘉嘉??王道斌

[摘要] 目的 探討血清和生物腫瘤標(biāo)志物CEA、CA153、CK19、HER2檢測(cè)在乳腺癌診斷中的臨床價(jià)值。 方法 選取不同臨床分期乳腺癌患者145例，乳腺疾病60例，正常對(duì)照50例。應(yīng)用蛋白芯片法、流式細(xì)胞術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)測(cè)定其水平和陽性表達(dá)率。結(jié)果 CEA、CA153水平在不同臨床床分期乳腺癌各組中差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在HER2表達(dá)為陽性的不同臨床分期各組中差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CEA、CA153、CK19陽性表達(dá)率在不同臨床床分期乳腺癌各組中差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而在HER2表達(dá)為陽性的平在不同臨床床分期乳腺癌各組中，Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌組分別與Ⅲ期、Ⅳ期乳腺癌組相比較，顯示出差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但Ⅲ期與Ⅳ期之間比較則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 CEA、CA153、CK19為乳腺癌重要的腫瘤標(biāo)志物，測(cè)定其水平和陽性表達(dá)率可作為臨床病情和療效監(jiān)測(cè)的輔助手段。

[關(guān)鍵詞]乳腺癌；腫瘤標(biāo)志物；CK19；HER2；聯(lián)合檢測(cè)

[中圖分類號(hào)] R725 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）08-37-04

生物腫瘤標(biāo)志物表皮生長因子受體（HER2）和上皮源性細(xì)胞特異性角蛋白19（CK19）表達(dá)乳腺癌的鑒別診斷和臨床療效起著較為重要的作用。而血清腫瘤標(biāo)志物CEA和CA153則更是臨床上廣泛應(yīng)用的標(biāo)志物，且具有取樣簡便、無創(chuàng)傷、可持續(xù)觀察等優(yōu)點(diǎn)。我們通過熒光原位雜交法（FISH）和先進(jìn)的流式細(xì)胞術(shù)（FCM）以及多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片法對(duì)145例不同期別的乳腺癌患者及60例乳腺良性腫瘤患者血清中的腫瘤標(biāo)志物CEA、CA15-3含量和HER2及CK19陽性表達(dá)率進(jìn)行檢測(cè)，并與50例正常人群進(jìn)行對(duì)照，探討它們?cè)谌橄侔┑脑\斷、治療及預(yù)后判斷中的臨床意義，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有病歷均來源于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科2008年1月～2009年12月收治的乳腺癌患者，每例均經(jīng)手術(shù)證實(shí)，病理資料完整，年齡26～70歲，平均（47.52±17.11）歲。所選病例Ⅰ期患者20例；Ⅱ、Ⅲ期患者各40例；Ⅳ期45例，而Ⅳ期患者中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例；肝、肺轉(zhuǎn)移各5例；骨轉(zhuǎn)移10例；腦轉(zhuǎn)移5例；多臟器轉(zhuǎn)移10例。而良性乳腺腫瘤患者60例，其中乳腺纖維腺瘤25例；漿細(xì)胞性乳腺炎15例；乳腺腺病10例；乳腺潴留囊腫5例；乳腺囊性增生病5例；年齡22～68歲，平均（51.25±16.23）歲。所有受試對(duì)象排除妊娠、感染、肝腎功能不全、代謝性疾病和心腦血管疾病等并發(fā)癥。另外選取本院健康體檢中心健康體檢者50例，年齡20～70歲，平均（42.17±19.89）歲。

1.2 樣本的制備

取受試對(duì)象清晨空腹靜脈血4.0 mL，分別置EDTA抗凝管2.0 mL、普通管2.0 mL，前者用于CK19檢測(cè)（應(yīng)在4 h內(nèi)完成檢測(cè)）；后者靜置后分離出清亮血清，置潔凈試管中，置-70℃低溫保存。供CEA、CA153檢測(cè)。良、惡性腫瘤患者均于手術(shù)前取樣，而需進(jìn)行治療的患者均于治療前取樣。健康對(duì)照組于體檢時(shí)取樣，血清待測(cè)樣品嚴(yán)禁溶血；抗凝血?jiǎng)t嚴(yán)禁血凝塊。同時(shí)收集經(jīng)外科手術(shù)受試對(duì)象乳腺癌蠟塊作為HER2檢測(cè)標(biāo)本。

1.3 檢測(cè)和判定方法

1.3.1 采用多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片診斷試劑盒（湖州數(shù)康生物科技有限公司提供）測(cè)定受試對(duì)象血清中的CEA、CA153的含量；以超出正常值上限為陽性（CEA<0.5?g/L、CA153<35 U/mL）

1.3.2 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)方法（美國Beckman Coulte EPICS-XL Ⅱ型流式細(xì)胞儀）測(cè)定CK19陽性表達(dá)率。抗凝外周血100?L，加入10?L CD45 PE-CY5，混均避光，25℃孵育10 min，加入打孔試劑100?L REG A，混均，避光反應(yīng)10 min，離心棄上清液，沉淀加入100?L REG B避光反應(yīng)5 min后，加入20?L CK19-FITC/ISO-FITC避光反應(yīng)15 min，離心，加入1 mL PBS重新懸浮細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。設(shè)置CK19本對(duì)照和陰性對(duì)照，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)每管標(biāo)本1×106～3×106細(xì)胞。激發(fā)波長λ=488 nm。陽性判斷：CD45perCP標(biāo)記陰性、CK19陽性者定為陽性（CK19+/CD45ˉ），如圖1。

1.3.3 應(yīng)用熒光原位雜交法（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增。HER2（FISH試劑盒選購北京金茗嘉生物技術(shù)有限公司，美國VYSIS公司進(jìn)口分裝）檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒附件說明書，按步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果分析：計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞統(tǒng)計(jì)Ratio值（Ratio值=30個(gè)細(xì)胞核中紅信號(hào)總數(shù)/30個(gè)細(xì)胞核中綠信號(hào)部數(shù)）。Ratio<1.8為陰性結(jié)果，提示：樣本無HER2基因擴(kuò)增；Ratio>2.2為陽性結(jié)果，提示：樣本中HER2基因發(fā)生擴(kuò)增。當(dāng)Ratio值在1.8～2.2之間時(shí)，可選擇增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個(gè)或采取重做FISH實(shí)驗(yàn)來判斷最終結(jié)果，如圖2。

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。CK19和HER2結(jié)果選用配對(duì)計(jì)數(shù)資料x2檢驗(yàn)（Me Nemar檢驗(yàn)）和Kappa檢驗(yàn)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

由表1可見，不同分期的乳腺癌各組CEA、CA153水平及CEA、CA153、CK19陽性表達(dá)率極顯著高于乳腺疾病組和正常對(duì)照組（P<0.01），乳腺疾病組與正常對(duì)照組之間差異無顯著性（P>0.05）；在不同臨床分期乳腺癌之間CEA、CA153水平及CEA、CA153、CK19陽性表達(dá)率，Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌組分別與Ⅲ期、Ⅳ期乳腺癌組比較、Ⅲ期乳腺癌組與Ⅳ期乳腺癌組比較均差異具有顯著性（P<0.05）；而HER2陽性表達(dá)率在不同臨床分期乳腺癌各組之間比較差異均無顯著性（P>0.05）。

由表2可見，HER2表達(dá)均為陽性的不同臨床分期的乳腺癌各組之間，CEA、CA153水平差異均具有顯著性（P<0.01）；而CEA、CA153、CK19的陽性表達(dá)率Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌組與Ⅲ期乳腺癌組、Ⅳ期乳腺癌組比較差異均具有顯著性（P<0.01）；但是，Ⅲ期乳腺癌組與Ⅳ期乳腺癌組比較，其CEA、CA153、CK19陽性表達(dá)率則差異無顯著性（P>0.05）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得到[1]CEA、CA153、Ck19敏感度分別為30.31%、50.75%、44.62%。而選擇3項(xiàng)聯(lián)合進(jìn)行檢測(cè)，按文獻(xiàn)[1]判定，對(duì)Ⅲ期、Ⅳ期乳腺癌的診斷敏感度可提高到84.60%，而同時(shí)也可達(dá)到較高的93.43%檢測(cè)特異度，與文獻(xiàn)較一致[2]。

3 討論

腫瘤標(biāo)志物是由腫瘤組織或細(xì)胞產(chǎn)生的某些生物化學(xué)物質(zhì)并存在于腫瘤組織中。這此生化物質(zhì)分泌至血液或其他體液中，其含量可代表腫瘤細(xì)胞的存在。因此檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物是早期診斷、治療腫瘤的重要手段之一[3]。

CA153被認(rèn)為是一種較好的乳腺癌血清標(biāo)志物[4]，并在乳腺癌中過度表達(dá)，與臨床分期、腫瘤負(fù)荷大小、腋窩淋巴結(jié)狀況及雌性受體相關(guān)[5]，而廣泛應(yīng)用于臨床的診斷和治療活動(dòng)中。但對(duì)早期的乳腺癌陽性表達(dá)率較低[6]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示在Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌受試者中，其陽性表達(dá)率也只有18.33%，與文獻(xiàn)[6]相一致。因此CA153單獨(dú)應(yīng)用具有一定的局限性。尤其是因?yàn)閷?duì)早期乳腺癌診斷敏感度較低而不能滿足臨床診療要求[7]。

CEA是胚胎性抗原，胎兒和成人消化道均產(chǎn)生。正常細(xì)胞分泌CEA進(jìn)入胃腸道，而失去極性的癌細(xì)胞分泌的CEA則進(jìn)入血液和淋巴，導(dǎo)致腫瘤患者血清中CEA異常性增高有文獻(xiàn)研究表明，乳腺癌患者中CEA水平與腫瘤的分和進(jìn)展呈正相關(guān)關(guān)系[8]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也得到相同的結(jié)論。

CK19在乳腺癌發(fā)生早期即有陽性表達(dá)。尤其在乳腺癌中高表達(dá)，同時(shí)其陽性表達(dá)率與腫瘤的負(fù)荷、轉(zhuǎn)移和臨床療效密切相關(guān)[9]。因此它是乳腺癌微轉(zhuǎn)移中研究、應(yīng)用最多的生物標(biāo)志物之一[10]。CK19檢測(cè)多采用PT-PCR方法，但該方法假陽性率高、易污染、特異度較低且費(fèi)時(shí)費(fèi)力成本高等缺點(diǎn)，而該法陽性檢出率也只有36%左右[11]，在臨床應(yīng)用上受限。我們采用先進(jìn)的流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)外周血CK19陽性表達(dá)率，不僅顯示出其客觀準(zhǔn)確性，同時(shí)還可進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行診斷。其敏感度達(dá)1～5×10-5。另外標(biāo)本為單細(xì)胞懸液，取樣簡便，極大地適用于臨床[12-13]。

HER2基因過表達(dá)不僅與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，而且是評(píng)估臨床預(yù)后的重要指標(biāo)[14]。我們實(shí)驗(yàn)顯示其總的陽性表達(dá)率為33.10（48/145），在不同臨床分期限各組乳腺癌患者比較差異均無顯著性（P>0.05）。但檢測(cè)HER2基因有無擴(kuò)增對(duì)乳腺癌患者后期治療、指導(dǎo)臨床在化療藥物選擇及判斷療效十分重要[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：CEA、CA153、CK19對(duì)觀察乳腺癌患者病情進(jìn)展、判斷療效可能具有一定的臨床意義。另外也提示在臨床工作中應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用多指標(biāo)檢測(cè)，可以彌補(bǔ)單指標(biāo)的缺陷和不足，提高診斷正確率，避免漏診、誤診的發(fā)生。如本實(shí)驗(yàn)單指標(biāo)的敏感度為30.31%～50.75%，而三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)敏感度可提高到84.60%。

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（收稿日期：2013-03-18）