紫薇基因組DNA的分離純化

賈永平 余占榮 張紅梅 孫毅

摘 要： 利用改良CTAB法提取了紫薇葉片細(xì)胞基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳紫外分光光度計進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，提取的DNA沒有明顯的降解，并有較高的濃度，純度一般。獲得的DNA可進(jìn)一步用于后續(xù)分子生物學(xué)試驗。

關(guān)鍵詞：紫薇；DNA；改良CTAB法；提取；測定

中圖分類號：Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.09.001

Isolation and Purification of the Genomic DNA from Lagerstroemia indica L.

JIA Yong-ping1， YU Zhan-rong2， ZHANG Hong-mei3，5， SUN Yi4，5

（1.Baode Seed Management Station of Shanxi Province，Baode，Shanxi 036600，China；2.Xinzhou Seed Control Station of Shanxi Province，Xinzhou，Shanxi 034000，China；3.Maize Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Xinzhou，Shanxi 034000，China；4.Biotechnology Research Center，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan，Shanxi 030000，China；5.Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministy of Agriculture，P.R.China，Taiyuan，Shanxi 030000，China）

Abstract： In this study，the genomic DNA of Lagerstroemia indica L. was isolated using improved CTAB method.The determined results of agarose gel electrophoresis and ultraviolet spectrophotometer showed its good integrity，high concentration and well purity.The DNA extracted from Lagerstroemia indica L. could be used in further molecular experiment.

Key words： Lagerstroemia indica L.；DNA；improved CTAB method；isolation； determination

紫薇（Lagerstroemia indica L.）又名百日紅、滿堂紅、癢癢樹，屬于千屈菜科紫薇屬[1]，是一種被廣泛種植的觀花樹種，為徐州市市花。原產(chǎn)于亞洲東部溫帶地區(qū)，在東亞分布甚廣，是我國夏季主要的園林綠化樹種。紫薇屬落葉灌木或小喬木，高可達(dá)7 m，樹冠不整齊，樹皮光滑，淡褐色，嫩枝四棱；葉對生，橢圓形至柜圓形，長3～7 cm；圓錐花序頂生，花有紅色、紫色。研究表明，紫薇有很多的藥效[2]。

植物DNA的提取和純化是植物基因工程研究的基礎(chǔ)操作，實施分子標(biāo)記。基因文庫構(gòu)建、基因分離及其遺傳轉(zhuǎn)化和鑒定等都以提取DNA為前提。如何簡捷有效地提取到純凈、合格的大分子雙鏈DNA，一直是植物生物技術(shù)研究者關(guān)注的問題。植物細(xì)胞不同于動物細(xì)胞，除了具有細(xì)胞壁外，還含有大量的多糖、脂質(zhì)、色素和酚類物質(zhì)，給DNA的提取和純化帶來許多困難。提取植物DNA常用的試劑主要是CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）和SDS（十二烷基磺酸鈉）[3-6]。CTAB和SDS都可以破壞植物細(xì)胞膜，以利于細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。此外，CTAB可與核酸結(jié)合形成復(fù)合物，有利于將DNA與變性蛋白質(zhì)及多糖分開、SDS可與蛋白質(zhì)、多糖等形成復(fù)合物，經(jīng)離心與DNA分開。

國內(nèi)外學(xué)者對紫薇進(jìn)行了栽培繁殖、引種、新品種選育、形態(tài)分類、進(jìn)化、數(shù)量分類、生理生化特性、病蟲害防治等方面的研究[7-10]，對于分子生物學(xué)方面的研究不多[11-12]。由于紫薇葉片內(nèi)多酚及多糖等次生代謝物質(zhì)含量高，葉片DNA提取也比較困難。為此，筆者以紫薇葉片為原材料，對紫薇基因組DNA進(jìn)行提取和純化，探索出一種高效提取純化紫薇基因組DNA的試驗方法，為后續(xù)研究提供DNA原料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采用鮮嫩的紫薇葉片。

1.2 試驗方法

本試驗采用改良CTAB法，具體步驟如下。

在10 mL離心管中，加入2 000 μL的2×CTAB提取緩沖液（2% CTAB，100 mmol·L-1 Tris-HCl，20 mmol·L-1 EDTA-Na2，1.4 mol·L-1 NaCl，1% PVP）和80 μL β-巰基乙醇，在65 ℃預(yù)熱。

嫩的組織材料1～2 g，用蒸餾水沖洗干凈，再用滅菌ddH2O沖洗2次，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，用干凈的滅菌不銹鋼勺轉(zhuǎn)移粉末至預(yù)熱的離心管中，總體積達(dá)到3～4 mL，混勻后置65 ℃水浴鍋中保溫45～60 min，并不時輕輕轉(zhuǎn)動離心管。

加等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），輕輕地顛倒混勻，室溫下10 000 r·min-1離心10 min，移上清至另一新管中。

向管中加入1/100體積的RNAase A （10 mg·mL-1）溶液，置37 ℃、20～30 min；加入2倍體積的無水乙醇，-20 ℃放置30 min，12 000 r·min-1離心10 min，回收DNA沉淀；用70%乙醇清洗沉淀2次，吹干后溶于50 μL的滅菌ddH2O中。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性；用紫外分光光度計測定提取DNA在波長為260 nm 和280 nm條件下的光吸收值，計算其濃度，并作純度分析；提取的DNA于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 提取DNA的完整性檢測

用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測，以水為空白對照，電泳緩沖液為1×TBE，電壓為80 V，電泳80 min，然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察成像，獲得的紫薇DNA質(zhì)量檢測結(jié)果如圖1。由圖1可以看出，DNA主帶很清晰，無彌散帶，說明提取的DNA有較好的完整性。

2.2 提取DNA的濃度和純度測定

取少量純化的紫薇DNA，稀釋50倍，在紫外分光光度計下測定其波長在260 nm和280 nm的光吸收值，并計算A260/A280值和DNA濃度（表1）。

表1顯示，提取的DNA具有較高的濃度，達(dá)到了440 ng·μL-1，但純度一般，可能有多酚及多糖等次生代謝物質(zhì)污染。

3 討 論

由于紫薇葉片內(nèi)多酚和多糖等次生代謝物質(zhì)含量高，為避免紫薇葉子中干擾DNA提取時的雜質(zhì)增多，采摘幼葉效果好。研磨之前，先將葉子放入4 ℃冰箱保存2 d，消化葉子中的糖類物質(zhì)；去除酚類物質(zhì)，向提取緩沖液中加入β-巰基乙醇和PVP防止材料褐化。

通常研磨材料的方法是在研缽中放入材料倒入液氮速凍進(jìn)行研磨，之后再將研磨好的樣品轉(zhuǎn)移至離心管中加緩沖液進(jìn)行DNA提取。這種方法需用材料量多，操作復(fù)雜，不適于轉(zhuǎn)基因植株大量樣品的檢測。另有報道，向離心管中加入石英砂，再倒入液氮速凍后用玻璃棒研磨，這種方法可將研磨的速度加快，但玻璃棒不如改裝的與離心管吻合的螺絲批方便、快速。用改裝的螺絲批研磨時，離心管中材料不宜太多，液氮要將材料凍透，研磨要充分。試驗證明，研磨越充分，提取DNA的量越多。整個研磨過程都要在冰上進(jìn)行，防止DNA降解。DNA提取過程中，保持低溫、動作溫和可有效避免DNA降解。

利用改良CTAB法從紫薇葉片中提取了基因組DNA，檢測結(jié)果顯示提取的DNA沒有明顯的降解，并有較高的濃度，純度一般。獲得的DNA可進(jìn)一步用于后續(xù)分子生物學(xué)試驗。

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