膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜不同部位基質(zhì)金屬蛋白酶3的表達(dá)及臨床意義

李守龍 艾依熱提·買買提 潘海濤 曾 崢

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院骨科，北京 100050;2.新疆油田公司明園職工醫(yī)院外科，烏魯木齊 830000)

膝骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis of knee，KOA)炎性反應(yīng)滑膜、滑膜內(nèi)血管組織及浸潤(rùn)的炎性反應(yīng)細(xì)胞可分泌炎性介質(zhì)及軟骨溶解酶至關(guān)節(jié)滑液中，通過(guò)關(guān)節(jié)滑液破壞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)［1］。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與其抑制劑即金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of matrix metalloprotein-ase，TIMPs)的平衡是維系關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)是導(dǎo)致軟骨破壞的關(guān)鍵酶，當(dāng)MMP-3的活性增高，并超過(guò)了TIMPs的增高程度時(shí)，MMPs/TIMPs失平衡，促使關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解，導(dǎo)致KOA的發(fā)生。臨床工作中發(fā)現(xiàn)KOA患者膝內(nèi)側(cè)疼痛癥狀出現(xiàn)早，關(guān)節(jié)間隙狹窄明顯。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究KOA滑膜不同部位MMP-3的表達(dá)強(qiáng)度及其臨床意義，討論MMP-3在KOA發(fā)病中的作用，為KOA臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料和標(biāo)本來(lái)源

選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院2010年7月至2012年3月收治的48例KOA患者為研究對(duì)象，其中男性16例，女性32例，年齡48～63歲，平均年齡53.4歲，病史最短1.5年，最長(zhǎng)12年，平均4.5年。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合骨關(guān)節(jié)炎的診斷依據(jù)［2］，并經(jīng)膝關(guān)節(jié)鏡檢查術(shù)證實(shí);②雙膝均患KOA者，以癥狀嚴(yán)重側(cè)入選;③無(wú)心血管、肝、腎等重要臟器病變;④排除活動(dòng)性消化性潰瘍及其病史;⑤排除類風(fēng)濕、感染性關(guān)節(jié)炎等其他關(guān)節(jié)疾患;⑥入選病例術(shù)前4周未使用非甾體類消炎藥(non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、皮質(zhì)醇或具有消炎鎮(zhèn)痛作用的中藥制劑。⑦術(shù)前均有膝關(guān)節(jié)疼痛。術(shù)前拍攝站立位患膝正側(cè)位X線片進(jìn)行Kellgren-Lawrence分級(jí)。所有患者均行膝關(guān)節(jié)鏡檢及關(guān)節(jié)滑膜清理術(shù)，術(shù)中分別取內(nèi)側(cè)間室、髕上囊及外側(cè)間室滑膜。

1.2 主要試劑及耗材

兔抗人MMP-3多克隆抗體及一抗稀釋液由北京嘉美諾斯生物科技有限公司提供，二抗EDTA 9.0及PV-6000即用型二步法檢測(cè)試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，CR機(jī)(Siemens公司，德國(guó))由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院放射科提供。萊卡自動(dòng)脫水機(jī)、DAB顯色劑、PBS緩沖液、蒸餾水由北京天壇醫(yī)院病理科提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

術(shù)中所取滑膜標(biāo)本用體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛固定，萊卡自動(dòng)脫水機(jī)脫水(全程14 h)，58℃～60℃石蠟包埋，切取4 μm厚切片，行針對(duì)MMP-3的HE染色及免疫組化染色。切片常規(guī)脫蠟至水。0.3%H2O2中室溫孵育10 min。微波抗原修復(fù)，92℃～98℃，5 min。正常山羊血清封閉液室溫孵育20 min，滴加一抗，置于37℃溫箱中60 min。滴加生物素化的羊抗兔Ⅱ抗，置于37℃的溫箱中60 min，DAB顯色。陰性對(duì)照標(biāo)本用PBS代替一抗。蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判定

1)免疫組化染色結(jié)果判定:采用半定量積分法［3］，分別對(duì)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行分級(jí)記分:①0、1、2、3分依次表示陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度為陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性;②陽(yáng)性細(xì)胞率:每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)40×10倍視野細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例分級(jí):無(wú)著色細(xì)胞或僅有﹤10%觀察細(xì)胞著色，0分;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～25%，1分;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～50%，2分;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)50%～70%，3分;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)70%～100%，4分。根據(jù)2項(xiàng)之和確定滑膜MMP-3表達(dá)強(qiáng)度。

2)臨床評(píng)分方法:應(yīng)用綜合評(píng)分方法［4］，根據(jù)患者病史及臨床查體、X線所見(jiàn)，匯總臨床癥狀(疼痛、行走困難)、體征(關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)活動(dòng)受限程度)及X線K-L分級(jí)5項(xiàng)指標(biāo)，各項(xiàng)指標(biāo)按無(wú)、輕、中、重分別計(jì)為0、1、2、3分，最高分為15分，對(duì)KOA患者作出臨床評(píng)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。不同部位滑膜MMP-3表達(dá)強(qiáng)度比較采用單因素重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析和兩兩比較檢驗(yàn)。滑膜MMP-3表達(dá)強(qiáng)度與臨床評(píng)分的關(guān)系采用相關(guān)系數(shù)r表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KOA滑膜不同部位MMP-3表達(dá)強(qiáng)度比較

MMP-3在KOA滑膜標(biāo)本中的滑膜襯里細(xì)胞層、滑膜襯里下層均見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，其中主要是滑膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞著色明顯，表現(xiàn)為胞核深染，胞質(zhì)中可見(jiàn)棕黃色或棕褐色顆粒分布(圖1)。細(xì)胞外基質(zhì)中也可見(jiàn)少量棕黃色顆粒均勻分布。MMP-3表達(dá)強(qiáng)度:內(nèi)側(cè)間室滑膜＞髕上囊滑膜＞外側(cè)間室滑膜，兩兩間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表1。

圖1 KOA滑膜MMP-3免疫組化染色Fig.1 Immunohistochemical staining for MMP－3 in synovial membrane of KOA(400×)

圖2 KOA滑膜不同部位MMP-3表達(dá)強(qiáng)度與臨床評(píng)分的相關(guān)關(guān)系Fig.2 Correlation of MMP－3 expression intensity in different sites of KOA synovial membrane with clinical scores KOA:osteoarthritis of knee;MMP-3:matrix metalloproteinase-3.

表1 KOA滑膜不同部位MMP-3的表達(dá)強(qiáng)度及臨床評(píng)分Tab.1 Expression of MMP－3 in different sites of KOA synovial membrane and clinical scores()

表1 KOA滑膜不同部位MMP-3的表達(dá)強(qiáng)度及臨床評(píng)分Tab.1 Expression of MMP－3 in different sites of KOA synovial membrane and clinical scores()

*P＜0.001 comparisons of every two sites in expression intensity of MMP-3 apso showed significant difference;KOA:osteoarthritis of knee;MMP-3:matrix metalloproteinase.

Sites Expression intensity Medial compartment 3.45±0.22*Suprapatellar bursa 2.69±0.21*Lateral compartment 1.99±0.16*Clinical scores 8.75±2.18 F 0.000 70.706 P

2.2 KOA滑膜不同部位MMP-3表達(dá)強(qiáng)度與臨床評(píng)分相關(guān)性

經(jīng)多元線性回歸分析，臨床評(píng)分與內(nèi)側(cè)間室滑膜、髕上囊滑膜、外側(cè)間室滑膜MMP-3表達(dá)強(qiáng)度間無(wú)多元線性關(guān)系(P=0.572)。內(nèi)側(cè)間室及髕上囊滑膜MMP-3表達(dá)強(qiáng)度與臨床評(píng)分分別呈正相關(guān)關(guān)系(圖2)，相關(guān)系數(shù)分別為 r1=0.894(P=0.000)，r2=0.803(P=0.000)。外側(cè)間室滑膜MMP-3表達(dá)強(qiáng)度與臨床評(píng)分無(wú)相關(guān)性r3=0.485(P=0.057)。

3 討論

KOA滑膜炎導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疼痛是KOA患者疼痛的重要原因，疼痛多是KOA患者的最初表現(xiàn)且先于X線或MRI的影像學(xué)表現(xiàn)而出現(xiàn)，滑膜炎性反應(yīng)參與了KOA 的整個(gè)病理過(guò)程［5-6］。有研究［7］發(fā)現(xiàn)，KOA 滑膜中浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞包括T輔助淋巴細(xì)胞、抑制性T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞，主要存在于滑膜襯里細(xì)胞層、滑膜襯里細(xì)胞下層以及小血管周圍。Hollander等［8］發(fā)現(xiàn)在離體條件下，由滑膜所分泌的關(guān)節(jié)滑液破壞關(guān)節(jié)軟骨的作用強(qiáng)于血清中細(xì)胞因子，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。滑膜釋放的炎性介質(zhì)IL-1β等可通過(guò)旁分泌或自分泌作用，使MMPs活性及含量增加，從而導(dǎo)致軟骨基質(zhì)分解，加劇KOA的進(jìn)程;IL-1β以及TNF-α又可通過(guò)激活細(xì)胞間因子NF-κB，后者可抑制軟骨再生所必需的轉(zhuǎn)錄因子SOX9的表達(dá)，從而抑制軟骨合成、修復(fù)，進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)軟骨破壞［9］，呈現(xiàn)出一種惡性循環(huán)。

KOA滑膜炎性反應(yīng)是關(guān)節(jié)軟骨或軟骨下骨破壞崩解后形成的二氫焦磷酸鈣結(jié)晶、軟骨碎屑導(dǎo)致的繼發(fā)反應(yīng)［7］，KOA滑膜為了溶解吸收關(guān)節(jié)腔內(nèi)磨損脫落的關(guān)節(jié)軟骨碎屑，代償性增生、肥厚并分泌軟骨溶解酶(包括MMP-3)，軟骨碎屑溶解的同時(shí)，正常的關(guān)節(jié)軟骨也同樣被溶解。Ishimaru等［10］證實(shí)患膝疼痛的KOA患者關(guān)節(jié)液及血清中MMP-3濃度明顯高于無(wú)痛患者，且MMP-3濃度與疼痛程度強(qiáng)烈相關(guān)，但與X線分級(jí)無(wú)相關(guān)性，由此可推測(cè)疼痛與KOA導(dǎo)致的滑膜炎性反應(yīng)有關(guān)，進(jìn)而與滑膜中MMP-3表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)。目前測(cè)定滑膜中MMP-3表達(dá)強(qiáng)度的研究報(bào)道少見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究KOA滑膜不同部位MMP-3的表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)側(cè)間室滑膜中MMP-3的表達(dá)，內(nèi)側(cè)間室＞髕上囊＞外側(cè)間室。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，患膝內(nèi)側(cè)及髕上囊疼痛、壓痛癥狀往往較外側(cè)重，其中以膝內(nèi)側(cè)癥狀為最重，且關(guān)節(jié)間隙明顯狹窄。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推測(cè)KOA膝內(nèi)側(cè)間室滑膜MMP-3表達(dá)強(qiáng)度較其他部位滑膜升高可能為患膝內(nèi)側(cè)臨床癥狀顯著的原因之一。

MMP-3的表達(dá)增高導(dǎo)致的KOA關(guān)節(jié)軟骨破壞以及滑膜炎性反應(yīng)可以刺激體內(nèi)傷害性感受系統(tǒng)，除產(chǎn)生主觀痛覺(jué)外，釋放到關(guān)節(jié)腔內(nèi)的炎性反應(yīng)介質(zhì)如P物質(zhì)(P substance，SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、緩激肽等能夠降低外周傷害性感受器的沖動(dòng)產(chǎn)生閾值，使其對(duì)痛性刺激更易感［11-13］。陳百成等［14］發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (nerve growth factor，NGF)和SP在KOA內(nèi)下方滑膜中表達(dá)增多，感覺(jué)神經(jīng)纖維在內(nèi)下方滑膜處增多，內(nèi)下方滑膜對(duì)傷害性刺激更敏感。另有研究［15］表明NGF在KOA患者滑膜組織的表達(dá)與KOA患者疼痛以及關(guān)節(jié)功能障礙呈正相關(guān)，內(nèi)側(cè)間室滑膜CGRP表達(dá)較外側(cè)間室及髕上囊增多［16］，內(nèi)側(cè)間室SP染色陽(yáng)性神經(jīng)纖維分布較正常密集，分布密度與疼痛VAS評(píng)分正相關(guān)［17］，這些與本實(shí)驗(yàn)得出的MMP-3在內(nèi)側(cè)間室滑膜表達(dá)較強(qiáng)的結(jié)果的意義相同，都可能是膝內(nèi)側(cè)疼痛和壓痛癥狀顯著的原因。滑膜內(nèi)陽(yáng)性神經(jīng)纖維存在于滑膜襯里細(xì)胞層，并有神經(jīng)纖維分支走向關(guān)節(jié)腔方向，而在襯里細(xì)胞下層，SP陽(yáng)性細(xì)胞主要存在于滑膜血管周圍，相當(dāng)數(shù)量的SP陽(yáng)性纖維存在于半月板與滑膜連接處［18］，結(jié)合上述研究發(fā)現(xiàn)，這支持臨床上行膝關(guān)節(jié)鏡下滑膜清理術(shù)后患膝疼痛減輕的現(xiàn)象，切除增生、肥厚滑膜可使滑膜中發(fā)放痛覺(jué)沖動(dòng)的傷害性感受器減少，同時(shí)阻斷了痛覺(jué)沖動(dòng)的向上傳導(dǎo)，臨床上表現(xiàn)為患膝疼痛減輕。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于髕上囊滑膜與外側(cè)滑膜中MMP-3表達(dá)強(qiáng)度或SP陽(yáng)性神經(jīng)纖維分布密度以及NGF表達(dá)強(qiáng)度比較的研究較少，本研究除發(fā)現(xiàn)內(nèi)側(cè)間室滑膜MMP-3表達(dá)強(qiáng)度高于髕上囊及外側(cè)間室滑膜外，還得出髕上囊滑膜MMP-3表達(dá)強(qiáng)度高于外側(cè)間室滑膜，雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果受滑膜標(biāo)本甲醛中貯存時(shí)間以及抗體純度、免疫組化染色過(guò)程中操作技術(shù)水平、鏡下觀片判斷等因素的影響，但入選患者亦存在不同程度的髕上囊部位壓痛，故髕上囊滑膜MMP-3表達(dá)強(qiáng)度高于外側(cè)間室滑膜的結(jié)論仍具有一定參考意義，它為臨床上決定滑膜切除范圍提供了依據(jù)，即關(guān)節(jié)鏡滑膜清理術(shù)中主要切除內(nèi)側(cè)間室、髕上囊滑膜可以緩解疼痛癥狀。

KOA臨床表現(xiàn)主要涉及關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)行走受限等方面，本研究結(jié)合患者上述臨床表現(xiàn)及膝關(guān)節(jié)平片Kellgren-Lawrence分級(jí)，對(duì)KOA組患者進(jìn)行臨床評(píng)分，并將其分別與內(nèi)側(cè)間室滑膜、髕上囊滑膜及外側(cè)間室滑膜中MMP-3表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)性分析，內(nèi)側(cè)間室及髕上囊滑膜MMP-3表達(dá)強(qiáng)度與臨床評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系(P=0.000)，據(jù)此可認(rèn)為KOA患者臨床評(píng)分與膝滑膜病變程度可相互反映，應(yīng)用MMP-3拮抗劑如四環(huán)素類抗生素、他汀類［19-20］等藥物，并聯(lián)合關(guān)節(jié)鏡下滑膜病變有限切除可緩解臨床癥狀、改善關(guān)節(jié)功能，亦能減緩炎性反應(yīng)滑膜分泌至關(guān)節(jié)滑液中的炎性介質(zhì)及MMP-3等軟骨溶解酶對(duì)于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，進(jìn)而減緩KOA的進(jìn)展，對(duì)于存在疼痛癥狀的早期KOA患者以及主觀不愿行膝關(guān)節(jié)置換而選擇保守治療的晚期KOA患者，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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