DNA甲基化轉移酶3B在腦膠質母細胞瘤中的差異表達

白 宇 陳 彥 國添柱 劉慶陽 楊 雪 馮 穎 閆卓紅 王麗佳 張權庚

(首都醫科大學基礎醫學院免疫學系，北京 100069)

DNA甲基化異常在腫瘤中非常普遍，包括全基因組的低甲基化和一些腫瘤抑制基因的驅動子區域的高甲基化。全基因組的低甲基化被認為是導致基因組不穩定性的主要原因，從而導致腫瘤干細胞中基因的一步步突變［1-2］，而腫瘤抑制基因驅動子區域的高甲基化直接導致這些基因的低表達或不表達［2-3］。腦膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是一種最常見惡性度最高的腦腫瘤，此病患者平均生存時間只有約14.5個月，與其他惡性腫瘤類似，DNA甲基化異常在這類腫瘤中非常普遍［1，4-5］。盡管腫瘤基因組甲基化異常已經被發現并被廣泛研究近30年，但導致這種異常的原因一直不明。新近有研究［6-7］顯示DNMT3A在約20%的急性髓細胞白血癥(acute myelocytic leukemia，AML)患者中發生突變而導致其活性喪失，但DNMT3A在GBM中的突變尚未有報道，并且即使AML中20%左右的DNMT3A突變也不能解釋腫瘤中的廣泛基因組低甲基化。推測仍然有其他原因與基因組的廣泛低甲基化有關［8-9］。

DNA甲基化是在DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferases，DNMT)的催化作用下完成的。DNA甲基化轉移酶主要包括 DNMT1，DNMT3A及DNMT3B。本研究主要探索DNMT3B是否在腦膠質母細胞瘤中有突變。

1 材料與方法

1.1 材料與標本

1)材料:RPMI1640培養基和PBS均購自美國Hyclone公司;小牛血清購自美國Gibco公司;Trizol購于美國 Invitrogen 公司;DEPC，DL2000、DNA Marker、MarkerⅣ、隨機引物均購自中國天根生化科技有限公司;M-MLV反轉錄酶、dNTP、primer star GLX均購自日本Takara生物技術有限公司;RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司。在中國美吉測序公司進行測序。序列比對使用DNASTAR7.1軟件。GBM細胞系LN229購于ATCC，并由本實驗室保存培養。

2)組織標本:25例GBM標本均來自首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科，腫瘤分級按照2007世界衛生組織(World Health Organization，WHO)劃分均為最高級Ⅳ級［10］。所有病例在外科手術前均未進行放射治療、化學藥物治療。所有患者均經影像學、臨床化驗指標及病理學診斷確診并建立完整的隨訪資料。標本在獲得后立即投入液氮中，一部分用于提取RNA，其余部分標本于－80℃保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計

根據 NCBI的 Genbank序列(序列號:NM-006892)對DNMT3B全長的擴增進行引物設計。DNMT3B上游引物:5'-CCTTCAAAGTGCCATGAGTTGTCTC-3'。下游引物:5'-TTCATACTCAGTTTGCAGCAATAGC-3'，擴增片段長度為2.5 kb。

1.2.2 細胞培養

GBM細胞系LN229，復蘇于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基的T75瓶中。于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。換液，傳代，待細胞穩定后使用。

1.2.3 總RNA提取

應用Trizol試劑從培養的LN229細胞中提取總RNA。每使用1 mL Trizol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min。4℃ 10 000 g離心15 min，把水相轉移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA，每使用1 mL Trizol加入0.5 mL異丙醇，室溫放置10 min。4℃ 10 000 g離心10 min，移去上清，75%乙醇洗滌RNA沉淀，每使用1 mL Trizol至少加1 mL 75%乙醇。4℃ 5 000 g離心5 min，棄上清，室溫放置干燥RNA沉淀，所獲 RNA用于 RT-PCR檢測或－80℃保存。

1.2.4 RT-PCR反應

反轉錄反應(reverse transcription，RT)使用 MMLV反轉錄酶，隨機引物擴增第一條鏈cDNA。所得cDNA進行下一步PCR反應。PCR反應體系均為25 μL，5 × PS 緩沖液 5 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物各0.5 μL，primer star GLX 0.25 μL，DNA 模版 2 μL，滅菌雙蒸水補足反應體積至25 μL。擴增條件為:95℃預變性3 min;98 ℃ 10 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 2.5 min，共35個循環;最后72℃延伸7 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。切膠測序。

1.2.5 DNA測序與分析

所有25個標本擴增的全長DNMT3B送美吉測序公司進行測序分析。測序結果使用DNASTAR7.1軟件進行比對。

2 結果

2.1 在腦膠質母細胞瘤細胞系中擴增全長DNMT3B

為摸索擴增全長DNMT3B cDNA的條件，首先培養LN229細胞，從中提取提取總RNA并用PCR方法擴增DNMT3B。成功擴增出全長DNMT3B約2.5 kb(圖1)。測序驗證該PCR產物包含完整DNMT3B的讀碼框架。

圖1 從GBM細胞系LN229中擴增DNMT3B全長Fig.1 Full-length cDNA of DNMT3B amplified from GBM cell line LN229

2.2 在腦膠質母細胞瘤組織中擴增全長DNMT3B

隨后對25例GBM組織的總RNA進行RT-PCR，成功擴增出全長DNMT3B基因，擴增產物為約2.5 kb的片段(圖2)。所得PCR產物經凝膠純化后送測序，對所得測序結果進行序列比對分析。

2.3 腦膠質母細胞瘤組織中DNMT3B基因型測序結果

將擴增出的25例GBM織的DNMT3B全長進行測序，并對測序結果進行比與NCBI中發表的DNMT3B讀碼框架進行比對，結果顯示所有標本中的cDNA均沒有氨基酸序列的點突變，但只有一例標本表達正常的DNMT3B轉錄本(樣本號:1073)，其余均檢測到不同的DNMT3B的剪切變異體，其中2例標本(樣本號:624，1074)只擴增出缺失外顯子 10，21，22的DNMT3B-V3變異體(圖3)，3例標本(樣本號:491，1103，1116)為主要表達缺失外顯子 5，10，21，22 的DNMT3B-V7變異體(圖4)，其余比對結果為亂碼，推測為多種變異體的混合物。

3 討論

圖2 25例GBM患者標本中擴增的DNMT3BFig.2 Results of RT－PCR to amplify DNMT3B from 25 GBM patient samples GBM:glioblastoma.

圖3 GBM樣本624和1074僅僅表達DNMT3B-V3剪切變異體Fig.3 GBM sample 624 and 1074 only expressed DNMT3B－V3

圖4 GBM樣本491，1103和1116僅僅表達DNMT3B－V7剪切變異體Fig.4 GBM sample 491，1103 and 1116 only expressed DNMT3B－V7

腫瘤基因組低甲基化自從1983年在結腸癌組織中被發現至今已有30年［11-12］。這種異常作為腫瘤表觀遺傳學異常的主體已幾乎各種人類中被發現并被廣泛進行了研究。這種異常在GBM中也非常普遍［4-5］，但導致這種異常的原因一直不明。研究腫瘤基因組低甲基化發生的原因不僅對理解腫瘤發生的機制具有重要意義，并且對腫瘤這種嚴重威脅人類生命和健康的防治具有重要意義。該研究以我們已建立的GBM標本庫對DNMT3B的突變進行了探索以期找出導致這種最常見的腦腫瘤基因組低甲基化的原因［13-15］。

DNA甲基化是由DNA甲基化酶在胞嘧啶5位碳原子上轉移上甲基的過程，使DNA甲基化是指DNA分子上CpG雙核苷中的胞嘧啶處于甲基化狀態，正常組織基因組70%CpG島被甲基化，是基因組的一種根本修飾。甲基化有兩種情況，一種是在DNA復制情況下，母鏈已經甲基化，新合成鏈發生的甲基化(又被稱為Maintenance甲基化)由DNMT1負責，另一種是對兩條鏈都沒有甲基化的模板進行甲基化，如沒有分化的干細胞，由 DNMT3A 和 DNMT3B 負責［8，16-17］。盡管DNMT3A被發現在約20%的AML腫瘤發生多位點的突變［6-7］，但在本課題組所檢查的約30例GBM中沒有發現這些突變，也沒有發現DNMT1的突變。在本研究中，也檢查了DNMT3B的點突變，在所有被研究的23例GBM中，也沒有發現改變氨基酸序列的點突變。這個結果顯示DNMTs的點突變不是導致GBM基因組低甲基化的原因。

盡管沒有DNMTs的點突變，但所研究的23例GBM標本中，只有一例以表達全長DNMT3B為主，2例表達缺失外顯子10、21、22的DNMT3B的V3剪切變異體，3例表達缺失外顯子5、10、21、22的 V7變異體，其余比對結果為亂碼，推測為存在多種變異體的混合物。目前NCBI中已知的DNMT3B轉錄變異體一共有6種，除無外顯子缺失的DNMT3B-V1外，其他剪切變異體均有外顯子缺失，分別為 DNMT3B-V2(缺失外顯子exon10)、DNMT3B-V3(缺失外顯子exon10，exon21，exon22)、DNMT3B-V6(exon10，exon21)、DNMT3B-V7(缺失 外 顯子 exon5，exon10，exon21，exon22)、DNMT3B-V8(exon4，exon5，exon10，exon21，exon22)。盡管 DNMT3B-V1和 DNMT3B-V3是被發現的最多的變異體，但是只有DNMT3B-V1，DNMT3B-V2被證明具有酶活性，而其他變體則由于缺失C 端催化區域而不具備酶活性［18-19］。Ostler等［20］在多種癌細胞系中一共發現了約20多種DNMT3B轉錄本，絕大多數缺失C末端缺失催化區，將DNMT3B-V7轉入293細胞改變其基因表達譜，其中一些基因的表達異常與DNA甲基化有關。在腎臟HEK293細胞中DNMT3B-V7轉錄本顯著改變DNA甲基化模式，但由于不尚不清楚哪個催化區是甲基化改變的原因，可能是縮短的DNMT3B-V7蛋白通過結合DNMT3B相關部分影響甲基化進程，或者是縮短的DNMT3B蛋白通過直接與DNA結合影響 DNMT酶的催化活性［21］。由于絕大多數GBM中以表達各種各樣的DNMT3B變異體為主，筆者推測GBM中廣泛的基因組低甲基化可能由于這些變異體引起。本課題組正擴大樣本數在GBM中研究這些DNMT3B變異體存在的圖譜，并研究這些變異體的存在基因組低甲基化狀態的相關性，希望進一步確定GBM以及其他腫瘤基因組低甲基化的根本原因。

［1］Eden A，Gaudet F，Waghmare A，et al.Chromosomal instability and tumors promoted by DNA hypomethylation［J］.Science，2003，300(5618):455.

［2］Feinberg A P，Ohlsson R，Henikoff S.The epigenetic progenitor origin of human cancer［J］.Nat Rev Genet，2006，7(1):21-33.

［3］Jones P A，Baylin S B.The fundamental role of epigenetic events in cancer［J］.Nat Rev Genet，2002，3(6):415-428.

［4］Noushmehr H，Weisenberger D J，Diefes K，et al.Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma［J］.Cancer Cell，2010，17(5):510-522.

［5］Cadieux B，Ching T T，VandenBerg S R，et al.Genomewide hypomethylation in human glioblastomas associated with specific copy number alteration，methylenetetrahydrofolate reductase allele status，and increased proliferation［J］.Cancer Res，2006，66(17):8469-8476.

［6］Le Gallo M，O'Hara A J，Rudd M L，et al.Exome sequencing of serous endometrial tumors identifies recurrent somatic mutations in chromatin-remodeling and ubiquitin ligase complex genes［J］.Nat Genet，2012，44(12):1310-1315.

［7］Ley T J，Ding L，Walter M J，et al.DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia［J］.N Engl J Med，2010，363(25):2424-2433.

［8］Kwon Y J，Lee S J，Koh J S，et al.Genome-wide analysis of DNA methylation and the gene expression change in lungcancer［J］.J Thorac Oncol，2012，7(1):20-33.

［9］Foltz G，Yoon J G，Lee H，et al.DNA methyltransferasemediated transcriptional silencing in malignant glioma:a combined whole-genome microarray and promoter array analysis［J］.Oncogene，2009，28(29):2667-2677.

［10］ Louis D N，Ohgaki H，Wiestler O D，et al.The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system［J］.Acta Neuropathol，2007，114(2):97-109.

［11］ Feinberg A P，Vogelstein B.Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts［J］.Nature，1983，301(5895):89-92.

［12］ Wu X，Rauch T A，Zhong X，et al.CpG island hypermethylation in human astrocytomas［J］.Cancer Res，2010，70(7):2718-2727.

［13］ Laffaire J，Everhard S，Idbaih A，et al.Methylation profiling identifies 2 groups of gliomas according to their tumorigenesis［J］.Neuro Oncol，2011，13(1):84-98.

［14］ Pennisi E.History of science.The case of the midwife toad:fraud or epigenetics［J］.Science，2009，325(5945):1194-1195.

［15］Etcheverry A，Aubry M，de Tayrac M，et al.DNA methylation in glioblastoma:impact on gene expression and clinical outcome［J］.BMC Genomics，2010，11:701.

［16］ Liu K，Wang Y F，Cantemir C，et al.Endogenous assays of DNA methyltransferases:Evidence for differential activities of DNMT1，DNMT2，and DNMT3 in mammalian cells in vivo［J］.Mol Cell Biol，2003，23(8):2709-2719.

［17］Hermann A，Gowher H，Jeltsch A.Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases［J］.Cell Mol Life Sci，2004，61(19 －20):2571-2587.

［18］ Robertson K D，Uzvolgyi E，Liang G，et al.The human DNA methyltransferases(DNMTs)1，3a and 3b:coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors［J］.Nucleic Acids Res，1999，27(11):2291-2298.

［19］Okano M，Xie S，Li E.Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA(cytosine-5)methyltransferases［J］.Nat Genet，1998，19(3):219-220.

［20］ Ostler K R，Davis E M，Payne S L，et al.Cancer cells express aberrant DNMT3B transcripts encoding truncated proteins［J］.Oncogene，2007，26(38):5553-5563.

［21］ Suetake I，Shinozaki F，Miyagawa J，et al.DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction［J］.J Biol Chem，2004，279(26):27816-27823.