骨骼風(fēng)痛片中雞血藤高效液相特征圖譜研究

徐 建，徐 云，王 鑫，王婷婷，徐國(guó)強(qiáng)，白 冰

(吉林修正藥業(yè)新藥開(kāi)發(fā)有限公司，長(zhǎng)春 130012)

骨骼風(fēng)痛片為修正藥業(yè)集團(tuán)通化通藥制藥股份有限公司生產(chǎn),由雞血藤、穿山甲、干姜3味藥制成，具有祛風(fēng)除濕，活血通絡(luò)，散寒止痛的功效，用于風(fēng)濕痹痛等癥。雞血藤為豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤莖，具有補(bǔ)血、活血、通絡(luò)之功，用于月經(jīng)不調(diào)，血虛萎黃，麻木癱瘓，風(fēng)濕痹痛等癥[1]，是處方中的君藥。

中藥特征圖譜能全面、綜合的反映所含成分的相對(duì)關(guān)系，較好的體現(xiàn)中藥成分的復(fù)雜性和相關(guān)性，具有特征明顯、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)[2-5]。本研究通過(guò)HPLC方法建立方中雞血藤藥材特征圖譜，從而確定成品中雞血藤的特征圖譜。由于雞血藤在骨骼風(fēng)痛片中是以水提物入藥，決定以雞血藤水提物為基礎(chǔ)，研究雞血藤原藥材與成品骨骼風(fēng)痛片的相關(guān)性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 HITACHI高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器；Mettler AE240十萬(wàn)分之一分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；AB204-E電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)等。

1.2 試劑與試藥 不同來(lái)源的雞血藤藥材，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10分別產(chǎn)自廣西白色、廣西寧明、廣西柳州、廣西憑祥、廣西寧明、廣西玉林、廣西欽州、廣東德慶、廣東高要、云南等地。藥材經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定；骨骼風(fēng)痛片(批號(hào):20120901)；乙酸乙酯、環(huán)己烷、磷酸、甲醇等為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[6]色譜柱GraceSmart RP 18 (5 μm,4.6 mm×250 mm) ；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(34∶66)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫40 ℃；流速0.8 mL/min。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取芒柄花素10 mg，用甲醇溶解于50 mL容量瓶中，稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液2 mL至10 mL容量瓶中混勻,甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取雞血藤藥材粗粉10 g，加水100 mL，100 ℃水浴回流提取2 h，趁熱過(guò)濾，濾液濃縮至20 mL，先用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，在水浴鍋上80 ℃蒸干，殘?jiān)盟?次，每次10 mL，合并補(bǔ)足20 mL，再用環(huán)己烷萃取3次，每次20 mL，合并環(huán)己烷液，在水浴鍋上80 ℃蒸干，殘?jiān)眉状枷礈?次，每次2 mL，定容至5 mL容量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.4 HPLC-UV特征圖譜方法學(xué)考查

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 選擇S1號(hào)雞血藤藥材，按照2.3項(xiàng)下制備方法制備供試品,按2.1項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣測(cè)量6次，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.12%～0.90%。表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取S1號(hào)雞血藤藥材，按照2.3項(xiàng)下制備方法制備供試品,按2.1項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣測(cè)量供試品制備方法制備6分樣品,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.11%～0.72%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取S1號(hào)藥材，按照2.3項(xiàng)下制備方法制備供試品,按2.1項(xiàng)下方法在0,2，6，8，12 h分別進(jìn)樣檢測(cè)，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.13%～0.33%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 特征圖譜的建立與相似度評(píng)價(jià)[7-11]

2.5.1 特征圖譜的建立 按2.3項(xiàng)下的方法制備10批不同產(chǎn)地的雞血藤藥材HPLC特征圖譜供試品溶液。按2.1項(xiàng)下方法依次進(jìn)行檢測(cè)，獲得10批不同產(chǎn)地的雞血藤藥材HPLC特征圖譜和共有模式圖根據(jù)10批供試品溶液的測(cè)定結(jié)果，標(biāo)定共有特征峰6個(gè),以3號(hào)共有峰(芒柄花素)作為參照峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，見(jiàn)表1。

表1 雞血藤藥材6個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)軟件,對(duì)10批樣品進(jìn)行分析，自動(dòng)生成雞血藤的對(duì)照特征圖譜，HPLC-UV特征圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較，尋找共有峰并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，見(jiàn)表2。

表2 雞血藤HPLC-UV特征圖譜相似度結(jié)果

結(jié)果:10批雞血藤藥材有相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.34%～2.16%，表明相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定。HPLC-UV特征圖譜的相似度均90%以上，可以認(rèn)定10批雞血藤藥材質(zhì)量相近。

3 骨骼風(fēng)痛片中雞血藤的特征圖譜研究

3.1 對(duì)照品溶液的制備

3.1.1 雞血藤藥材對(duì)照品溶液的制備 取雞血藤藥材10 g,精密稱(chēng)定，粉碎后按2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備，即得。

3.1.2 陰性對(duì)照品溶液的制備 按照骨骼風(fēng)痛片的工藝,制備缺少雞血藤藥材的陰性樣品。取樣品10 g，精密稱(chēng)定，粉碎后按2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備，即得。

3.2 供試品溶液的制備 取骨骼風(fēng)痛片(批號(hào)：20120901)10 g，精密稱(chēng)定，粉碎后按2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備，即得。

3.3 特征峰的確定 為了確定雞血藤的相關(guān)成分在骨骼風(fēng)痛片圖譜中的體現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)將芒柄花素對(duì)照品溶液、雞血藤藥材對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液、骨骼風(fēng)痛片供試品溶液按特征圖譜建立的色譜條件分別進(jìn)樣并比較，確定雞血藤的特征峰。

取上述4種樣品分別注入高效液相色譜儀記錄色譜并比較,結(jié)果可以看出 2、3、6號(hào)共有峰為骨骼風(fēng)痛片中雞血藤的特征峰，其中3號(hào)峰為芒柄花素。

4 討論

從相對(duì)保留時(shí)間來(lái)看，該特征圖譜建立的方法可用于控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，同時(shí)通過(guò)考察雞血藤和骨骼風(fēng)痛片的相關(guān)性，將成品中3個(gè)特征峰歸屬為雞血藤藥材，并通過(guò)對(duì)照品，確定了其中的1個(gè)特征峰為芒柄花素。雞血藤藥材特征圖譜的建立及成品中雞血藤特征峰的確定可以為骨骼風(fēng)痛片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考。

[1]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:180.

[2]蔡寶昌,潘揚(yáng),殷武.指紋圖譜在中藥研究中的應(yīng)用[J].世界科學(xué)技術(shù),2000,2(5):9-14.

[3]韓紅祥,王維,陳雪松,等.應(yīng)用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)研究不同基源蜂膠指紋圖譜[J].吉林中醫(yī)藥,2011,31(12):1221-1223.

[4]程誼.中藥指紋圖譜在質(zhì)量評(píng)價(jià)中的作用概述[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2008,15(6):107-108.

[5]劉浩,屈凌波,相秉仁.系統(tǒng)生物學(xué)與中醫(yī)藥現(xiàn)代化[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,25(3):450-451.

[6]李瑩,陳曉輝,張?zhí)旌?等.RP-HPLC法測(cè)定雞血藤中芒柄花素的含量[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,26(12):975-977.

[7]張凌,劉亞麗,饒志軍.豐城雞血藤活性成分HPLC指紋圖譜研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,20(1):80-84.

[8]丁平,仰鐵錘,林振坤,等.雞血藤化學(xué)成分的指紋圖譜研究[J].華西藥學(xué)雜志,2010,25(4):461-463.

[9]李紅,蔣孟良.國(guó)藥竹瀝及其偽品的HPLC指紋圖譜比較研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(3):527-529.

[10]嚴(yán)啟新,李萍.雞血藤高效液相色譜指紋圖譜研究[J].中草藥,2004,35(5):556-559.

[11]李靈,李惠勇,張玲,等.川赤芍藥材高效液相指紋圖譜的研究[J].吉林中醫(yī)藥,2009,29(4):333-335.