骨痛膏對家兔骨愈合過程中骨形態發生蛋白表達的影響

楊濟洲，徐 林

(北京中醫藥大學東直門醫院 骨科，北京 100700)

骨折愈合是骨科領域中研究較多的課題，中醫藥在治療骨折、促進骨愈合方面積累了豐富的經驗，有其特有的優勢。骨痛膏源自吉林省民間驗方，在臨床應用多年，療效確切，本實驗以家兔骨缺損模型為觀察對象，以骨折愈合過程中BMP-2mRNA為研究對象。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 骨痛膏(由藏紅花、血竭、自然銅、三七、木香、米醋組成，長春呈實健康實業有限公司生產制備)，批準文號：吉衛健用字(2008)第12號。

1.1.2 動物 選用健康、雄性、3月齡日本大耳白兔30只，體質量：(2±0.5) kg，由中國中醫科學院基礎所動物中心提供。

1.1.3 試劑與儀器 戊巴比妥鈉，北京市化學試劑公司提供；DAB顯色試劑盒、AR1022，武漢博士德生物工程有限公司；BMP-2原位雜交檢測試劑盒，天津市灝洋生物制品科技有限公司；光學顯微鏡：OLYMPUS BX51連接OLYMPUS DP70采集器(DP Controller采集軟件)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將30只成年雄性日本大耳白兔隨機分成2組，分別為國新牌骨痛膏外用藥組和空白對照組，每組15只。再將每組15只隨機分成3個亞組，即第1周取標本組(A組)、第2周取標本組(B組)、第4周取標本組(C組)，每次參加檢測的動物：10只(20個橈骨標本)。

1.2.2 動物模型制作方法 30只日本大耳白兔均以手術造成雙橈骨中段寬約3 mm、深達髓腔的缺損骨折模型。取兔稱重，以3%戊巴比妥鈉，按30 mg/kg體質量腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，將兔仰臥于臺上，前肢剪毛，碘伏消毒，鋪無菌孔巾，前肢中段橈骨背側行2 cm縱行切口，依次切開皮膚、皮下組織，暴露橈骨中段，于旋前圓肌止點下切開骨膜，剝離1 cm左右，用咬骨鉗造成寬約3 mm、深達髓腔的骨質缺損，注意勿損傷神經、血管，生理鹽水沖洗，逐層縫合皮下組織及皮膚。用藥組外敷骨痛膏，所有模型兔均以石膏夾板外固定。術后連續3 d肌注青霉素以預防感染，40萬u/次，2次/d。

1.2.3 給藥方法 造模成功后即開始對實驗組外用骨痛膏，將藥涂抹于透氣棉布上,環繞橈骨(手術切口0.5 cm以內不用)外敷骨折處,外用石膏夾板固定，每2 d換1次藥。空白對照組予石膏夾板外固定。

1.2.4 標本取材 兔耳緣靜脈注入空氣約2 mL，將實驗兔空氣栓塞致死，造模后第7天處死A組，第14天處死B組，第28天處死C組。自肘關節離斷，取雙側前肢送檢。

1.2.5 觀察指標 1)原位雜交染色觀察及分析：取包括骨折斷端及其周圍軟骨痂約1 cm。標本置入質量分數為4的多聚甲醛中固定48 h后，再經質量分數為125 g/L EDTA-Na24 ℃下徹底脫鈣，每4 d更換脫鈣液1次。待針可刺入骨皮質時停止脫鈣,隨后用石蠟包埋，制備6 μm厚度切片,切片經脫蠟水化后，經山羊血清封閉內源酶，按原位雜交操作規范及試劑盒說明進行試驗。原位雜交設空白對照,平行操作，標記探針均用PBS緩沖液替代。陽性細胞漿和(或)膜著色呈棕黃色。以每個切片6個視野的陽性細胞數之平均數代表該切片的陽性細胞數，6個視野的總MOD之平均數為該切片陽性細胞MOD值。用LEICA DM6000B病理圖像分析儀Leica Qwin Pro圖分析軟件對BMP-2mRNA染色面積測定，A、B、C各組進行t檢驗。

2 結果

2.1 一般情況 各組實驗兔麻醉清醒后即能用前肢著地，處于正常的蹲伏狀態,術后第1天即能在籠中自如活動，并能正常取食及飲水。各組實驗兔傷口無紅腫、滲液，呈一期愈合。肉眼觀察術肢局部組織情況，外用藥組血腫機化、表面骨痂出現較早且明顯。

2.2 原位雜交染色觀察及分析 術后第1周，用藥組即出現纖維性骨痂并出現BMP-2mRNA擴增表達，在外骨痂一些成熟軟骨細胞中亦可見BMP-2mRNA擴增表達,對照組未見骨痂，在成纖維細胞中未見明顯陽性染色細胞。術后第2周,用藥組可見大量BMP-2mRNA陽性染色細胞，陽性表達集中在成骨細胞、骨細胞、軟骨基質、間質細胞等，對照組軟骨細胞、成骨細胞及周圍基質均呈弱陽性表達，且著色明顯淺于用藥組。術后第4周陽性細胞數量及范圍明顯下降，骨小梁排列緊密，編織骨已向板層骨轉化，陽性染色程度明顯減弱，在軟骨細胞中仍有少量表達，成熟的骨細胞未見明顯陽性染色，但著色較淺，骨小梁排列稀疏，可見著色的軟骨細胞、成骨細胞等。在全部切片中骨痂局部BMP-2mRNA濃度最高，正常骨組織未見陽性染色。縱向比較，2組術后染色均呈先強后弱，術后染色高峰出現在術后2周。橫向比較，用藥組陽性染色均較對照組強，尤其在第1、2周。這與免疫組化染色結果完全吻合。陽性顆粒平均光密度值和陽性產物平均積分光密度比較，見表1。

表1 不同觀察時間骨痂中BMP-2 表達光密度均值(±s)

3 討論

中醫外治法治療骨折有著悠久的歷史，早在漢代的《居延漢簡》中就記載了漢代軍醫以膏藥為主治療各種創傷的方藥和方法。清代名醫吳機師提出“凡病多從外入，故醫有外治法，經文外取內取并列，未嘗教人專用內治也。”和“外治之理即內治之理，外治之藥亦即內治之藥，所異者法爾”的觀點為后世骨傷醫家所推崇。中醫學認為，骨折愈合的過程就是“瘀祛、新生、骨合”的過程。骨痛膏是由藏紅花、血竭、自然銅、三七、木香、米醋調制而成。方中藏紅花、血竭、三七活血化瘀、消腫止痛。木香行氣止痛。自然銅散瘀止痛、接骨續筋，《本草經疏》中記載“自然銅乃入血行血，續筋接骨之要藥也”。米醋性寒味酸，具有軟堅散結作用，作為載體和滲透劑與他藥合用可增加活血止痛作用[1]。諸藥合用共奏行氣活血、接骨續筋之功。故從理論上講在骨折的治療中，骨痛膏完全符合中醫骨折外治的治則。大體觀察藥組骨痂出現時間明顯早于對照組、骨痂量明顯多于對照組，可以早期提供骨缺損區的穩定，臨床可以早期開始行功能鍛煉，減少一些并發癥的出現。4周時用藥組骨愈合情況亦明顯優與對照組,說明外用骨痛膏可以明顯促進骨愈合。本實驗BMP-2mRNA的轉錄水平呈動態變化,即骨折后開始升高,2周左右達到高峰,以后逐漸下降,這與王鵬程等[2]的研究近似。施萊[3]研究認為，中藥對骨形成的影響可能通過介導BMP而發揮作用。本實驗結果顯示，骨痛膏可明顯促進BMP-2mRNA的表達,促進骨折的愈合，說明外用中藥可以明顯促進骨愈合。目前，外用中藥在骨愈合方面的研究鮮見，但在民間應用廣泛，對于骨痛膏中的透皮機理及具體有效成分以及促進骨愈合的具體機制等方面還有待研究。

[1]王靜,毛春芹,陸兔林,等.中藥醋制法研究進展[J].中國中醫藥信息雜志,2009,16(1):99-101.

[2]王鵬程,張英澤,劉勇謙,等.內源性骨形態發生蛋白在骨修復中的作用[J].中國矯形外科雜志,1999,6(5):348.

[3]施萊.中藥加速骨折愈合機理的研究[J].長春中醫藥大學學報,2010,26(4):601.