常壓室溫等離子體快速誘變酒精酵母及其突變株的特性研究

王方方，孫沛勇，銀會娟，尹 迪

（河南天冠企業集團有限公司，河南 南陽 473000）

目前，世界各國經濟發展都面臨能源供應安全和生態環境保護的雙重壓力，為了實現能源、環境和經濟的持續協調發展，各國都在致力于可再生能源的開發和研究[1-2]。乙醇除廣泛應用于食品、醫藥衛生、化工等領域外，還被公認為最具有發展前景的可再生清潔能源之一。我國燃料乙醇產業從2001年起步，現己擴大到十幾個省份。2002年國家在黑龍江、河南、安徽三省新上了3個總設計規模為90萬噸的建設項目[3-5]。2005年世界乙醇的總產量達到108億加侖，2000～2005年其產量以平均每年18.5%的速度遞增[6]。未來乙醇的應用主要體現在3個方面：車用燃料、燃料電池的燃料以及成為支撐現代以乙烯為原料的石化工業的基礎原料。目前世界乙醇產量的80%以上是通過釀酒酵母以淀粉質或其他糖質原料發酵生產的[7]。為了提高淀粉利用率，降低糧耗，獲得高產酒精酵母菌株顯得尤為重要。新的微生物菌種決定著微生物代謝產品，但菌種的生產能力高低，則決定著微生物產品的開發和生產前景，因此，微生物的誘變育種是極其重要的環節[8]。近期利用常壓室溫等離子體技術對酒精酵母進行誘變處理，效果比較理想。

常壓室溫等離子體（atmospheric room temperature plasma，ARTP）誘變技術具有射流溫度低、產生的等離子體均勻、無需真空裝置、操作簡易、成本低、與生物大分子和細胞作用明顯等優點[9-10]，已成為快速突變微生物基因組的有效方法。前期的研究結果表明，ARTP技術可以快速有效地突變細菌、微藻、酵母菌等微生物[11-12]。

對酒精酵母來說發酵終了酒精含量是一個重要指標，其測定方法使用蒸餾法[13]。本研究通過對出發菌株和誘變后單菌落進行發酵實驗，綜合比較實驗結果，進行復篩-再復篩的驗證以及遺傳穩定性的實驗，以確定出最優突變株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

培養基：種子培養基：自制麥芽汁，濃度12°Bx～14°Bx，121℃、30min滅菌；斜面：在麥芽汁中加入1.8%（w/v）的瓊脂粉，121℃、30min滅菌；發酵培養基：生產用糖化醪，100℃、90min滅菌。

菌株：生產用酵母菌。

1.2 儀器與設備

ME403E電子天平：梅特勒-托利多；SHP-80（D）電熱恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；ZHWY-211C恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-150KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 培養及保存方法

誘變前處理：原種由斜面活化后，挑取適量接入種子培養基中，28℃、150r/min培養12h；誘變后篩分：平板單菌落接入種子培養基，于28℃進行液體試管培養，16h后轉接入三角瓶進行28℃、150r/min搖床培養，9h后轉接入發酵培養基進行發酵實驗；保存方法：4℃低溫保存。

1.3.2 ARTP誘變方法

誘變至對數生長期的酵母種子液經預處理后涂布于載片表面，將載片置于載臺上，用ARTP誘變育種系統2mm射距照射，分別照射0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s、120s、150s、180s，將經過處理后的載片放于裝有1mL生理鹽水的離心管中，振蕩均勻后稀釋至10-1、10-2、10-33個梯度，每個梯度涂布平板2個。

1.3.3 分析方法[13]

酒精度測定分析方法：準確量取發酵醪100mL，注入1000mL平底燒瓶內，加水120mL，將平底燒瓶和冷凝器連接好，注意勿使漏氣。置電爐上加熱蒸餾，餾出液收集于100mL量筒內，當餾出液達到100mL刻度時，取下搖勻，以酒精度計與溫度計同時測其酒度和溫度，根據酒精度和溫度換算表，換算為20℃時的酒精度。

1.3.4 計算公式

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變致死率曲線的測定

前期研究發現，等離子體對細菌細胞壁、細胞膜及蛋白質都有顯著的作用效果，處理時間長會導致細胞壁部分或者完全的破裂，釋放出細胞內蛋白[14]。這是由于等離子體產生的活性粒子能夠破壞細胞結構也能夠穿過細胞壁到達細胞內，打斷基因、蛋白鍵等，從而導致大部分微生物死亡[15]。但少數經過ARTP照射的微生物會通過本身的自動修復系統修復存活，并在這一過程中產生基因突變。因此，選擇合適的ARTP操作條件能夠實現微生物的快速誘變。

由圖1可知，等離子體對酵母菌的殺傷力有一個突變的過程，處理時間低于60s時，酵母菌的致死率為0；處理時間為75s時，致死率約為24%；而處理時間為90s時，有一個顯著突變，從24%躍升為90%，因此可以確定酵母的致死時間為90s。由于菌株的突變具有隨機性，其致死率和突變率及突變方向的關系不是十分清楚，與誘變方法和菌種本身的特性密切相關。本實驗選取致死率在90%以上的單菌落進行篩分實驗。

圖1 酒精酵母的致死率曲線Fig.1 Fatality rate curve of alcohol-producing yeast

2.2 酵母突變體的篩分實驗

由于實驗條件所限，對于酵母突變體的篩分實驗選用傳統的篩分方法。從ARTP處理并經梯度稀釋得到的平板上挑取單菌落，接種至10mL裝量的液體試管中，28℃培養16h，接入裝有80mL培養基的小三角瓶中，28℃、150r/min搖床培養，8h后接入270g發酵培養基中，接種量為10%，34℃靜置培養。發酵期間進行定時稱質量，以失質量不超過0.2g/h為發酵終點。

對初篩試驗的結果進行統計，參照不同的突變標準得出的正負突變率數值見表1。

表1 不同突變標準下正負突變率結果統計Table 1 Positive or negative mutation rate under different mutation standards

突變標準是指（目標菌酒精度/出發菌酒精度-1）*100%所得的結果。從表1結果可以看出，菌株發生正負突變的情況均有發生，且隨著突變標準的不斷提高，負突變率結果逐漸高于正突變率。對于突變標準超過3%的5個菌株，其發酵酒精度和糖醇轉化率見表2。

表2 較優突變株的初篩結果Table 2 Preliminary screening result of excellent mutant strains

表2中Y2和Y4酒精度較低，是因為發酵培養基初始濃度低的原故。因為發酵所使用的糖化醪直接從生產上糖化罐中取用，不同的配料批次糖化醪濃度存在一定的差別。

2.3 較優突變株的復篩實驗

為了驗證突變株的發酵實驗結果，對初篩中發酵結果比較理想的5株突變株Y1、Y2、Y3、Y4和Y5和出發菌株再連續進行2次發酵實驗，發酵結果見表3。

表3 較優突變株的復篩結果Table 3 Rescreening result of excellent mutant strains

從表3發酵結果可以看出，這5株菌發酵穩定性和平行性較好，其發酵結果趨勢比較一致。

2.4 遺傳穩定性實驗

通過初篩和復篩實驗結果可以看出，篩選出的5株突變株較出發菌株酒精度有一定程度的提高。為了檢測篩選出菌株的遺傳穩定性，對突變株進行傳代，并對某些傳代次數的突變株進行發酵實驗，實驗結果見表4。

表4 較優突變株遺傳穩定性實驗結果Table 4 Genetic stability experiments result of excellent mutant strains

分析結果表明，等離子誘變的酵母突變株都保持著良好的遺傳穩定性。

2.5 發酵期間失重情況變化

圖2 酵母菌發酵期間失重情況Fig.2 Weight loss during alcohol-producing yeast fermentation period

從圖2酵母菌發酵失重情況可以看出，菌株的發酵周期分為延遲期、對數期以及穩定期。剛接入發酵培養基時，菌株需要一個逐漸適應新環境的過程，此為延遲期，該階段菌種的發酵表現為延遲，失重緩慢；菌株適應新環境后，快速利用培養基中的糖分，發酵迅速；發酵后期，培養基中糖分基本消耗殆盡，發酵緩慢，失重情況趨于穩定。對比出發菌株，突變株在發酵前期速度慢于出發菌株，隨著發酵過程的不斷進行，突變株失重逐漸超過出發菌株，至發酵結束，失重高于出發菌株。通過失重情況可初步判斷突變株的發酵結果優于出發菌株。

3 結論

通過系列實驗結果可知，ARTP誘變育種方法可快速有效地誘變酒精酵母，而且突變效果良好。通過對近100個單菌落的初篩，以發酵終酒精度為指標，其中正突變率超過3%的突變株有5個。通過對5個較優突變株的反復篩分，確定其突變效果。并對具有優良突變效果的突變株進行數次傳代，通過實驗驗證突變株具有較好的遺傳穩定性。

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