酶解-超聲波-表面活性劑協同提取桑葉總黃酮工藝研究

董樹國，陸 釗

（吉林醫藥學院藥學院，吉林 吉林 132013）

桑葉為桑科植物的干燥葉子，具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目的功能。桑葉中含有氨基酸、維生素、多糖、生物堿和黃酮等多種生物活性成分，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗炎、抗衰老等功效。黃酮是桑葉的重要的活性成分[1-3]，具有多種生物活性。桑葉黃酮的提取方法主要有有機溶劑提取[4]、微波輔助提取[5]和超聲波輔助提取[6]。酶解提取是利用酶的高活性和高選擇性，在適宜的條件下，較溫和地分解植物組織，提高提取效率的方法，已廣泛用于中藥活性成分提取[7-11]。表面活性劑協同提取是利用表面活性劑降低表面張力，增強溶劑對物料的潤濕性和滲透性，對天然產物的有效成分具有增溶作用，從而增加浸出效能和萃取率，已在天然產物提取中得到較多的應用[12-15]。本實驗利用纖維素酶對桑葉進行酶解，以表面活性劑的水溶液為提取劑，利用超聲波輔助提取桑葉中的總黃酮，并對提取工藝條件進行優化，為進一步研究高效、低成本的桑葉總黃酮的提取分離工藝提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉購于吉林大藥房；Tween-80、纖維素酶、蘆丁標準品（純度＞98%）購于國藥集團上海試劑公司；甲醇、乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉均為國產分析純，實驗用水為蒸餾水

1.2 儀器與設備

T6-新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；KQ-250E超聲波清洗儀：昆山市超聲波儀器有限公司；FA1104型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：金壇市環宇科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備

取過40目篩的桑葉粉末4.0g置于錐形瓶中，加入40mg纖維素酶（按桑葉質量的1.0%加入），適宜pH值的緩沖溶液40mL，在一定溫度條件下酶解2h后，加入不同質量濃度的Tween-80 溶液120mL，超聲（250W、40kHz）提取一段時間后，過濾，濾液移入250mL容量瓶，以蒸餾水稀釋至刻度，得到樣品溶液，備用。

1.3.2 標準曲線的繪制及樣品總黃酮的測定

準確稱取蘆丁標準品50mg于燒杯中，以少量甲醇溶解，移入25mL容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，得質量濃度為2mg/mL的蘆丁標準溶液。

精密量取蘆丁標準溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL，分別置于10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，放置6min后，加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻放置6min，加4%氫氧化鈉溶液4mL，以30%vol乙醇溶液定容至10mL，搖勻放置15min，以相應的試劑為空白，在波長510nm處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，擬合出回歸方程為Y=0.0386+0.00612X，r=0.9994，結果表明，蘆丁質量濃度為20μg/mL～100μg/mL時，蘆丁質量濃度與吸光度值之間具有良好的線性關系。

準確移取樣品溶液2mL，按照上述的實驗方法測定吸光度值，根據標準曲線方程計算相應的總黃酮濃度。

1.3.3 總黃酮提取率的計算

根據測定的樣品中總黃酮含量，計算提取液中總黃酮的含量，總黃酮的提取率的計算公式：

1.3.4 單因素試驗

以總黃酮提取率為考察指標，分別對酶解溫度、pH值、Tween-80質量濃度，提取時間進行單因素試驗。

1.3.5 正交試驗在單因素試驗的基礎上，進行提取條件優化正交試驗，確定最佳提取工藝條件。

2 結果與分析

2.1 酶解溫度對總黃酮提取率的影響

取4.0g桑葉，加入1.0%纖維素酶，緩沖溶液（pH5.5）40mL，分別在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃進行酶解2h，加入質量濃度為1.00%的Tween-80溶液120mL，超聲波（250W、40kHz）提取40min，按實驗方法1.3.2測定總黃酮的含量，并計算總黃酮的提取率，結果見圖1。由圖1可知，當溫度為50℃時，總黃酮的提取率最大，溫度低影響酶的活性，溫度過高可能導致酶失活，影響催化效果。

2.2 酶解pH值對總黃酮提取率的影響

取桑葉4.0g，加入1.0%纖維素酶，分別加入pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的緩沖溶液40mL，于50℃酶解2h，加入質量濃度為1.00%的Tween-80溶液120mL，超聲波（250W、40kHz）提取40min，按實驗方法1.3.3測定提取液中總黃酮含量并計算總黃酮提取率，結果見圖2。由圖2可知，在pH值為6.0時總黃酮提取率最大。

圖2 pH值對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of pH value on extraction rate of total flavonoids

2.3 Tween-80質量濃度對總黃酮提取率的影響

取桑葉粉末4.0g，加入1.0%纖維素酶，緩沖溶液(pH6.0)40mL，50℃酶解2h，加入質量濃度分別為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%的Tween-80溶液120mL，超聲波（250W、40kHz）提取40min，按實驗步驟1.3.3，測定總黃酮含量，并計算總黃酮提取率，結果見圖3。由圖3可知，隨著Tween-80質量濃度的增加，總黃酮提取率增加，在Tween-80質量濃度為1.00%時，總黃酮提取率最大，而后總黃酮提取率下降。

圖3 Tween-80質量濃度對提取率的影響Fig.3 Effect of Tween-80 concentraction on extraction rate of total flavonoids

2.4 提取時間對總黃酮提取率的影響

稱取桑葉粉末4.0g，加入1.0%纖維素酶，緩沖溶液（pH6.0）40mL，50℃酶解2h，加入質量濃度1.00%的Tween-80溶液120mL，超聲波（250W、40kHz）提取10min、20min、30min、40min、50min，按方法1.3.3測定吸光度值，計算總黃酮提取率，結果見圖4。由圖4可知，隨著提取時間的增加，總黃酮提取率增加，但40min后總黃酮提取率增加緩慢。

2.5 提取工藝優化正交試驗

根據單因素試驗結果，選取酶解溫度、pH值、Tween-80質量濃度、超聲提取時間為主要影響因素，進行L9（34）正交試驗，以桑葉總黃酮提取率為考察指標，對4個影響因素進行優化。正交試驗因素水平見表1，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

圖4 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids

表1 提取工藝條件優化正交試驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for process opimization

表2 提取工藝條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for process optimization

表3 提取工藝條件正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment result

由極差分析結果（表2）可知，試驗中各因素的影響次序為C（Tween-80質量濃度）＞D（提取時間）＞A（酶解溫度）＞B（pH值），其最佳工藝組合為A2B3C2D3，即酶解溫度50℃，pH值為6.5，Tween-80質量濃度為1.00%，超聲提取時間50min。由表3的方差分析可知，因素C（Tween-80質量濃度）對總黃酮提取率影響較為顯著。

在優化工藝條件下，對3份桑葉進行總黃酮提取，其總黃酮提取率分別為1.34%、1.29%、1.27%，總黃酮平均提取率為1.30%，未用纖維素酶對桑葉進行酶解時，桑葉總黃酮提取率1.03%，表明酶解可破壞桑葉細胞壁，從而提高總黃酮提取率。酶解-超聲波-表面活性劑提取總黃酮的優化工藝穩定，能夠提高總黃酮提取率。

3 結論

利用纖維素酶對桑葉進行酶解，破壞桑葉細胞壁，以低質量濃度Tween-80水溶液為提取劑，超聲波協同提取桑葉總黃酮能夠增加黃酮的溶解提高提取率。本實驗研究了酶解溫度、pH值、Tween-80質量濃度、超聲提取時間對桑葉總黃酮提取率的影響，利用正交試驗對酶解-超聲波-表面活性劑協同提取桑葉總黃酮的工藝條件進行優化，確定的最佳提取工藝條件為酶解溫度50℃，pH值6.5，Tween-80質量濃度1.00%，提取時間50min。在最佳提取工藝條件下，桑葉總黃酮的提取率為1.30%。

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