響應面優化超聲輔助提取昆侖雪菊原花青素的工藝研究

賀 翠，王燕芳，馬 超，謝 利，魯小靜，吳 瑛*

（1.塔里木大學 生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護與利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

昆侖雪菊（Kunlun chrysanthemum）為菊科（Asteraceae）金雞菊屬（CoreopsisLinn）多年生草本植物兩色金雞菊（C.tinctoria），其維語名稱為古里恰依（Gulqai），生長在新疆和田海拔3200m～5000m以上的高寒山區環境中生草本植物[1]。昆侖雪菊被新疆維吾爾醫院作為一種維藥材應用，具有清熱毒、胃健脾之功，當地居民把昆侖雪菊當花茶飲用[2]，昆侖雪菊可藥食兩用，有較大的市場前景。

原花青素[3-6]是昆侖雪菊中的次生代謝產物，具有極強的穩定性和抗氧化能力，能夠抑制血小板凝聚及脂質過氧化，提高人體免疫力和防御紫外線輻射[7-8]。原花青素可開發為用于防治心腦血管疾病的藥物，近年來成為某些疾病抑制的研究熱點[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆侖雪菊（樣品由新疆和田陽光沙漠玫瑰有限公司提供，陰干，粉碎，過60目篩。

1.2 儀器與設備

S54紫外分光光度計：上海棱光有限公司；SY-500超聲波萃取儀：上海寧商超聲儀器有限公司；CP224C 電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司。

原花青素標準品購于天津晶純實業有限公司，硫酸鐵銨，甲醇，正丁醇，濃鹽酸等試劑為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 原花青素標準曲線的繪制

采用鐵鹽催化比色法[10-11]。準確稱取原花青素標準品25mg，用甲醇溶解置于100mL容量瓶中定容。準確吸取原花青素標準品溶液0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL、1.1mL、1.2mL定容至10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。分別準確移取1.0mL以上溶液于10mL具塞試管中，加入9.0mL比為83∶6∶1的正丁醇∶濃鹽酸∶10%硫酸鐵銨反應混合液，混勻，置于沸水浴中加熱40min后，立即取出冰浴冷卻4min，取出后恢復至室溫，同樣處理的甲醇為空白調零，在測定A550nm。

1.3.2 原花青素的含量測定

精密稱取昆侖雪菊粉末1.000g于6個50mL圓底燒瓶中，分別加入萃取液在不同條件下提取。每次提取液過濾3次，將濾液合并，定容于50mL容量瓶中，再從其中取出1mL于10mL具塞試管中，測定提取液中原花青素的含量。提取率計算公式：

式中：C 為濃度，mg/mL；V 為體積，mL；D 為稀釋倍數；m 為樣品質量，g。

1.3.3 單因素試驗[8]

精密稱取昆侖雪菊粉末1g于6個50mL圓底燒瓶中，分別加入萃取液在不同條件下提取。每次提取液過濾3次，將濾液合并，濃縮后定容于50mL容量瓶中，測定提取液中原花青素的含量。分別考察乙醇體積分數、超聲功率、料液比、鹽酸用量等因素對昆侖雪菊原花青素提取率的影響。

1.3.4 Box-Behnken試驗[13-14]

運用Design-Expert軟件，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，采用4因素3水平的旋轉組合設計[15]確定最佳提取工藝，因子水平及編碼見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結果與分析

2.1 原花青素標準曲線制作

圖1 原花青素標準曲線Fig.1 Standard curve of proanthocyanidins

以A550nm為縱坐標，原花青素質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程：y=1.784x+0.0094，r=0.9994，原花青素標準品溶液在0～1.2mg/mL有良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響

圖2 乙醇體積分數對原花青素提取率影響Fig.2 Effect of ethanol fraction on proanthocyanidins extraction rate

從圖2可以看出，當料液比為1∶20、超聲功率為35W、鹽酸用量為3.5mL時，隨著乙醇體積分數的增加，昆侖雪菊原花青素的提取率相應提高，乙醇體積分數為60%vol時提取率最高。當乙醇體積分數高于60%vol時，原花青素提取率逐漸降低，確定昆侖雪菊原花青素的最佳提取乙醇體積分數為60%。

2.2.2 料液比對原花青素提取率的影響

圖3 料液比對原花青素提取率影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on proanthocyanidins extraction rate

從圖3可以看出，當乙醇體積分數為60%、超聲功率為35W、鹽酸用量為3.5mL時，隨著料液比的增加，昆侖雪菊原花青素的提取率相應提高，料液比為1∶20時提取率最高。當料液比為高于1∶20時，原花青素提取率變化趨勢趨于穩定，確定昆侖雪菊原花青素的最佳提取料液比為1∶20。

2.2.3 超聲功率對原花青素提取率的影響

從圖4可以看出，當乙醇體積分數為60%、料液比為1∶20、鹽酸用量為3.5mL時，昆侖雪菊原花青素的提取率隨超聲功率的增加而得到相應提高，超聲功率為40W時提取率最高。當超聲功率高于40W時，原花青素提取率趨于穩定，考慮到能耗問題，選擇昆侖雪菊原花青素的最佳提取超聲功率為35W。

圖4 超聲功率對原花青素提取率影響Fig.4 Effect of ultrasoud power on proanthocyanidins extraction rate

2.2.4 鹽酸用量對原花青素提取率的影響

從圖5可以看出，當乙醇體積分數為60%、料液比為1∶20、超聲功率為35W時，隨著鹽酸（0.1mol/L）用量的增加，昆侖雪菊原花青素的提取率增加，當鹽酸用量高于3.5mL時，原花青素提取率降低，確定昆侖雪菊原花青素的最佳提取鹽酸用量為3.5mL。

圖5 鹽酸用量對原花青素提取率影響Fig.5 Effect of hydrochloric acid content on proanthocyanidins extraction rate

2.3 響應曲面優化試驗結果與分析

根據Box-Behnken中心試驗方案進行4因素3水平試驗，其結果見表2。

表2 響應面分析試驗結果Table 2 Design and results of response surface methodology

按照Box-Behnken中心試驗原理，利用Design-Expert 7.1.6軟件對試驗數據進行二次響應面回歸分析，其結果見表2。通過回歸分析可得出影響因素的一次效應、二次效應及其交互效應的關聯方程，獲得提取昆侖雪菊原花青素的多元二次模擬回歸方程：y=1.69+0.042A+0.35B-0.05C+0.033D-0.18AB+0.12AC-0.17AD+0.097BC+0.19BD-0.12CD-0.27A2-0.54B2-0.27C2-0.13D2。決定系數R2=0.929，說明該模擬方程的擬合度較好[16-17]。

本試驗采用F檢驗方法對模型的顯著性進行分析，回歸方程的方差分析結果（見表3），其二次響應面回歸模型F值為13.170，并且p＜0.0001說明該方程模型極顯著，可預測對不同萃取條件下原花青素的提取率。方程式中，一次項，二次項，交互項均與響應值回歸關系顯著，其中B、A2、B2、C2對原花青素的提取率的影響為差異極顯著（p＜0.01），AB、AC、AD、BD在p＜0.05水平顯著，其余項均不顯著。該模型失擬項p值0.2383，大于0.05，模型失擬不顯著，說明該模型有效，預測決定系數R2=0.9290，調整系數R2Adj=0.8590，說明兩者存在高度相關[18]，因而該模型擬合度比較好，運用該模型可以較好地分析響應值的變化。從響應面回歸方程F檢驗值可以得出，影響昆侖雪菊原花青素提取率大小的因素依次為料液比（B）＞乙醇體積分數（C）＞鹽酸用量（D）＞超聲功率（A）。

表3 二次響應面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic response surface regression model

圖6～圖8是原花青素提取率響應值與相對應的影響因素：乙醇體積分數（C）、超聲功率（A）、料液比（B）、鹽酸用量（D）交互作用構成的三維空間響應面與等高線圖，圖6～圖8中曲面顏色越深，說明對原花青素提取率的影響越顯著，等高線形狀越趨向于橢圓形交互作用越顯著。結果得出料液比和超聲功率，乙醇體積分數和料液比，鹽酸用量和料液比，鹽酸用量和乙醇體積分數這4組因素的交互作用顯著，原花青素的提取率在一定程度上會隨著4個因素的增加迅速增大，當達到實驗所取各因素中心值時，提取率又會隨這4個因素的增加而下降，整體呈現拋物線形狀[19]。

圖6表明，當乙醇體積分數為60%，鹽酸用量為3mL，超聲功率不變的情況下，隨著料液比的增加，昆侖雪菊中原花青素的提取率迅速增大，而后逐漸下降[20]。

圖7表明，當鹽酸用量為3.5mL，超聲功率為35W，料液比不變的情況下，隨著乙醇體積分數的增加，原花青素的提取率逐漸增加。

圖6 料液比與超聲功率對原花青素提取率影響響應面與等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour map of effect of interaction between material/liquid ratio and ultrasonic power on proanthocyanidins yield

圖7 乙醇體積分數與料液比對原花青素提取率的影響的響應面與等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour map of effect of interaction between ethanol volume fraction and material/liquid ratio on proanthocyanidins yield

圖8表明，當乙醇體積分數固定在60%，超聲功率固定35W，料液比不變的情況下，原花青素的提取率會隨鹽酸用量的增加而提高。

圖8 鹽酸用量與料液比對原花青素提取率影響響應面與等高線圖Fig.8 Response surface plot and contour map of effect of interaction between hydrochloric acid dosage and material/liquid ratio on proanthocyanidins yield

2.4 工藝條件和驗證試驗

利用Desigh Expert軟件得到最佳工藝條件為提取超聲功率35W、乙醇體積分數為60%，料液比為1∶20，鹽酸用量3.5mL在此條件下進行3次平行實驗。昆侖雪菊原花青素平均提取率為1.76%（n=3，RSD=1.68%），與理論預測值1.79%相比，其相對誤差約為0.03%，且重復性很好，說明優化結果可靠。

3 結論

響應面優化昆侖雪菊原花青素最佳提取工藝條件為超聲功率為35W、料液比為1∶20、乙醇體積分數為60%、鹽酸用量為3.5mL，實際提取率達到理論預測值的98.324%。

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