乳酸菌發酵生產乳酸鈣的條件優化

陳文潔，張京震，郭建峰*

（1.中北大學 化工與環境學院，山西 太原 030051；2.山西省經濟建設投資有限公司，山西 太原 030012）

乳酸鈣是一種重要的化工原料，主要應用于食品、醫藥和飼料行業。在食品工業中，乳酸鈣作為安全的食品添加劑，可用于固化劑、風味增強劑、調味劑、配料、食品松軟劑、營養供應品及穩定劑和增稠劑使用；在醫藥行業是人和動物的主要補鈣劑；在輕工行業作為抗菌劑和除垢劑用于牙膏中[1-3]。

由于目前乳酸鈣的制備成本偏高，有效地降低乳酸鈣生產成本對其市場應用具有積極的推動作用[4-5]。工業中淀粉廢水的排放量與日俱增，會污染環境且造成資源浪費[6]。為了充分利用廢水中的淀粉等資源，降低乳酸鈣生產成本，試驗通過葡萄糖作為乳酸菌生長發酵的碳源，對乳酸菌生長和發酵條件進行優化，探索最優發酵工藝條件，提高乳酸鈣產量，為后續研究利用淀粉廢水發酵提供理論依據和試驗基礎條件。以其為后期的應用探索合適發酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌種

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）：試驗室儲藏；脫脂乳粉為市售。

1.1.2 培養基

MRS固體培養基：在MRS培養基中加入1.5%瓊脂。發酵培養基：葡萄糖，酵母膏，MgSO4·7H2O，磷酸二氫鉀。保藏培養基：在MRS培養基中加入1%的CaCO3。

1.2 儀器與設備

BS210電子天平：上海精密科學有限公司；YXQ-SG46-280S手提式高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-2F無菌操作臺：寧波科森凈化器制造有限公司；DHP060型恒溫培養箱：上海飛越試驗儀器有限公司；PHS-3C精密pH計：杭州奧利龍有限公司；721可見分光光度計：上海第三分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

乳酸菌的活化：取一環生長良好的斜面種子，接入液體活化培養基中，至于36℃培養箱中培養，連續活化2次備用。乳酸菌富集培養：在無菌條件下，用移液管吸取一定量活化后的菌懸液，加入MRS培養基中，置于恒溫培養箱中培養。

乳酸菌發酵產酸培養：在250mL錐形瓶中加入50mL發酵培養基，在無菌條件下，用移液管吸取一定量活化后的菌懸液，加入發酵培養基中，置于恒溫培養箱中培養。

發酵法制取乳酸鈣：將活化后的菌懸液接入添加有碳酸鈣的發酵培養基中，在試驗所得的最優條件下進行培養。

1.3.2 分析方法

（1）乳酸菌生長情況測定

用移液管吸取培養一定時間后的菌懸液，稀釋5～10倍后，使用721分光光度計在波長660nm處測定其吸光度值。

（2）發酵產酸量測定

用0.1mol/L的NaOH對發酵液進行滴定，溴甲酚紫為指示劑，溶液由橙黃色變為藍紫色即達到滴定終點[7]。記錄滴定消耗NaOH的體積數，mL。

乳酸產量按下式計算：

式中：X 為乳酸產量，g/L；VNaOH為滴定消耗的氫氧化鈉體積數，mL；90.08 為乳酸的摩爾質量，g/mol；V為樣品的體積，mL。

（3）乳酸鈣總量的測定

本試驗通過乙二胺四乙酸二鈉中和滴定法測定所產乳酸鈣的總量[8]。

1.3.3 乳酸鈣的提取方法

將在最佳條件下獲得的發酵液過濾，以除去菌體及未反應的碳酸鈣，在濾液中加入氧化鈣調pH值至12～13，并加入0.4%的MgSO4沉聚菌體蛋白[9-11]，在80℃，攪拌反應30min后，趁熱抽濾得乳酸鈣母液，再將母液進行加熱濃縮，當母液中乳酸鈣質量濃度達到145g/L～15g/L[12-13]時，冷卻靜置結晶24h。分離晶體和母液，由于乳酸鈣在水中的溶解度較大，結晶母液中還留有大量的乳酸鈣，濃縮后再次結晶，合并晶體[14]。

1.3.4 乳酸菌生長條件單因素試驗

（1）乳酸菌生長曲線的測定

制備7瓶50mL相同條件的MRS培養基，按2%的接種量接種，30℃條件下進行培養，在2h、5h、8h、12h、15h、20h、24h 后分別取出一瓶測其OD值，以確定菌種生長情況。

（2）不同pH值對乳酸菌生長情況影響

在6個裝有50mL MRS培養基的錐形瓶中，添加氫氧化鈉或乙酸調整培養基的起始pH值，分別為3.2、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，按2%的接種量接種，在30℃條件下進行培養，12h后測其生長情況。

（3）不同的培養溫度對乳酸菌生長情況的影響

將裝有50mL MRS培養基的錐形瓶滅菌后，按2%的接種量接種，分別放置于28℃、30℃、32℃、36℃、38℃、40℃、42℃條件下培養12h后，測量生長情況。

（4）不同的接種量對乳酸菌生長情況的影響

在裝有50mL MRS培養基的錐形瓶中，用滅菌后的移液管分別接入2%、5%、8%、10%、12%、15%的乳酸菌菌懸液，在之前試驗確定的最佳溫度條件下培養12h后測其生長情況。

（5）不同的裝液量對乳酸菌生長情況的影響

分別往6個250mL的錐形瓶中加入25mL、50mL、75mL、100mL、150mL、200mL的MRS培養基，并接入2%的乳酸菌菌懸液[15]，置于之前試驗確定的最佳溫度下培養12h后，分別測其生長情況。

1.3.5 發酵條件優化正交試驗

將酵母膏、MgSO4·7H2O、磷酸二氫鉀的用量固定，以酸度為考察指標，優化溫度（A）、時間（B）、接種量（C）、葡萄糖含量（D）和初始pH值（E）為5個因素，設計L16（45）正交試驗分析發酵培養基優化結果，因素水平見表1。

表1 發酵培養基優化L16(45)正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of the L16(45) orthogonal experiment for fermentation medium optimization

2 結果與分析

2.1 生長曲線的測定

圖1 菌種生長曲線Fig.1 The growth curve of lactic acid bacteria

菌液的OD值在一定程度上反映了菌體的生長情況，由圖1可知，菌體經過較短的延遲期后即進入對數生長期，到12h時達到較高水平，此后雖然OD值一直增大但變化幅度趨于平穩，表明菌株此時進入穩定期。

2.2 乳酸菌生長條件單因素試驗

2.2.1 初始pH值的影響

pH值是影響微生物生長代謝的一個重要因素，乳酸菌在生長過程中，對pH值有著嚴格的要求。37℃培養12h后，測其OD值，試驗結果見圖2。

圖2 pH值對乳酸菌生長的影響Fig.2 Effect of pH value on the growth of lactic acid bacteria

由圖2可知，在一定的pH值范圍內，初始pH值越高，菌種生長越好，在pH值為6.0時，菌種達到最佳生長條件，隨后pH值的增大會抑制菌種生長。因此，之后發酵優化中初始pH值選取在5.5～7.0的范圍內。由于pH值在自然情況下，生長情況尚好，為方便起見，后期試驗采用自然條件的pH值。

2.2.2 裝液量的影響

裝液量將直接影響培養基里的供氧量，過多將影響菌體的呼吸作用，菌體的生長將受到抑制，過少將浪費培養基里的氧氣。本試驗選取了10%～80%的裝液量做單因素試驗，37℃培養12h后，測其OD值，結果見圖3。

圖3 裝液量對菌種生長的影響Fig.3 Effect of liquid volume on the growth of lactic acid bacteria

從圖3可知，乳酸菌雖為兼性厭氧菌，但是裝液量越少時，生長越好，由于10%的裝液量過少，且20%的裝液量效果尚佳，所以之后發酵選擇20%的裝液量。

2.2.3 接種量的影響

將活化后的乳酸菌種子培養基分別以2%、5%、8%、10%、12%、15%接種量接種于MRS培養基中，37℃培養12h后，測其OD值，結果見圖4。

從圖4可知，接種量為8%時，菌種生長最佳，在低于8%時，接種量越高，生長越好，當接種量高于8%時，生長量反而減少。由于2%～10%接種量的結果（OD值）差距不大，所以在活化菌種時為節約菌種采用2%的接種量，之后發酵水平選取在2%～10%的區間內。

圖4 接種量對菌種生長的影響Fig.4 Effect of inoculum on the growth of lactic acid bacteria

2.2.4 溫度對菌種生長的影響

乳酸菌的生長隨溫度變化，試驗分別在28℃、30℃、32℃、36℃、38℃、40℃培養12h。OD值變化見圖5。

圖5 溫度對菌種生長的影響Fig.5 Effect of temperature on the growth of lactic acid bacteria

從圖5可知，乳酸菌生長OD值在32℃～38℃較高，在35℃～37℃達到最高水平。在此水平前，菌種隨溫度的升高而呈現良好的生長趨勢，高于此水平溫度時，菌種受高溫的抑制，雖然可以生長，但生長變得緩慢。

2.3 菌種發酵條件的優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以滴定酸度為考察指標采，用L16（45）進行正交試驗，結果見表2。由表2可知，最優組合為A4B4C3D4E4，即培養溫度40℃，培養時間96h，接種量8%，葡萄糖含量10%，初始pH值為7.0。由極差大小可知，因素對菌種發酵產酸影響主次順序為時間＞溫度＞接種量＞葡萄糖含量＞初始pH值。

按照優選出的發酵培養基條件A4B4C3D4E4制備發酵培養基，葡萄糖含量為10%，初始pH值為7.0，接種量為8%，于40℃培養96h，其最終酸度為75°T。

2.4 乳酸鈣的測定和提取

表2 發酵培養基優化的L16(45)正交試驗結果與分析Table 2 Result and analysis of the L16(45) orthogonal experiment for fermentation medium optimization

在最優發酵條件的培養基中加入碳酸鈣，其用量為乳酸產量的120%，即0.52g，按照最優條件進行發酵，反應結束后，用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）滴定發酵液，測得乳酸鈣含量為27.28g/L。

將4瓶50mL發酵液統一處理，通過純化除雜，濃縮結晶得乳酸鈣成品3.93g，計算得乳酸鈣提取率為72.0%。

3 結論

單因素試驗結果表明，乳酸菌種子培養基的最佳條件為接種量8%，裝液量20%，溫度36℃，初始pH值為6.0，接種后12h菌種活性較高，適合下一代的接種。對乳酸桿菌進行乳酸發酵優化后，確定了最佳發酵條件：時間96h，溫度40℃，葡萄糖含量10%，接種量8%，初始pH值為7.0。各因素對發酵產酸的影響順序為時間＞溫度＞接種量＞碳源＞初始pH值。在最優條件下進行發酵，可得乳酸產量為8.64g/L，發酵液中乳酸鈣含量可達27.28g/L。通過過濾除去菌體和未反應的碳酸鈣，等電點沉淀法除去蛋白質，濃縮結晶提取乳酸鈣。最終乳酸鈣的提取收率為72%。該研究僅對菌種生長條件和發酵培養基條件進行了研究，葡萄糖轉換率較低，今后可以對該菌進行誘變[16-17]以提高菌種性能和乳酸產量。

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