高效酒精酵母菌選育及其特性研究

羅躍中，李忠英，李繼睿，吳永堯

（1.湖南化工職業技術學院，湖南 株洲 412004；2.湖南農業大學 生命科學院，湖南 長沙 410128）

隨著全球石油能源的日趨枯竭及環境污染的加劇，開發新的綠色能源勢在必行，燃料酒精替代汽油能源將逐漸成為發展趨勢[1-2]。目前，燃料酒精生產多采用微生物發酵方式。生產酒精的菌種以酵母菌為主，酒精酵母的優劣不僅直接影響發酵率的高低，而且會影響酒精的產量和品質。在酒精發酵時，產生的高濃度酒精和相對較高的發酵溫度對產酒率影響較大，高濃度酒精會限制酵母菌的生長繁殖，對酒精發酵產生強烈的抑制作用；與此同時，受季節變化和發酵過程放熱使溫度不斷升高也會限制酵母的發酵。酵母發酵適宜溫度是30℃～33℃，一般不超過36℃，溫度過高，會導致酵母老化和死亡，使發酵過程不能正常進行，酒精得率降低。而耐高溫酵母能減少生產中由于降溫所帶來的麻煩和費用。因此，高產酒精酵母的選育和發酵工藝的改進是實現酒精濃醪發酵工業化生產的關鍵[3-6]。

本研究從自然界中篩選分離出具有較強溫度和酒精耐受性的酵母菌株，經紫外線和亞硝酸誘變得到一株高產突變株UV-N-5，提高了其產酒精能力，同時也對其生理特性進行研究，旨在篩選培育適用于酒精工業發酵的新菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌樣來源

各種腐敗水果、葡萄園里土壤、湘天橋菜市場甜酒醪、湘鄉燕京啤酒廠酒醪、學生食堂下污水及實驗室教學用酵母菌等。

1.1.2 主要培養基

富集培養基：含10%vol酒精麥芽汁（8°Bx）、含14%vol酒精麥芽汁（10°Bx）。

分離馴化培養基：麥芽汁（8°Bx）及酵母蛋白胨葡萄糖培養基（YPD）：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，若制備YPD固體培養基，加入2%瓊脂粉。

篩選培養基：TTC上層培養基為TTC 0.05g，葡萄糖0.5g，水1L；TTC下層培養基為YPD瓊脂。

種子培養基：葡萄糖1.0g/L，KCl1.5g/L，酵母浸膏2.5g/L，醋酸鈉8.0g/L。

酒精發酵培養基：葡萄糖5g/L，玉米漿20g/L，尿素2g/L。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外分光光度計：日本島津公司；XB124-S電子天平：梅特勒電子儀器有限公司；超凈工作臺：江蘇凈化設備廠；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械；HPS-250生化培養箱：哈爾濱市東明科技有限公司；QYC-21全溫空氣搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；S2617R顯微鏡：江南光電股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預處理

將采集的樣品加無菌水振蕩1h，打碎菌膠團，釋放游離菌備用。

1.3.2 富集培養

在振蕩處理后的菌懸液中取5mL，分別加入至已滅菌的酒精度為10%vol的培養基中，40℃培養24h，再轉入酒精度為14%vol的培養基中，45℃培養24h，鏡檢。配制成合適的菌懸液并取lmL接入YPD固體平皿中，45℃培養2d～3d，經鏡檢為純種后分別轉入YPD固體斜面，冰箱保存。

1.3.3 酵母菌的篩選

TTC法[7-8]：將分離得到的各菌株活化后依次接入TTC下層培養基的平皿中，培養24h，長出菌落后倒入TTC上層培養基，40℃保溫（陰暗處）2h～3h，成深紅色菌落，將酵母菌接種于YPD固體培養基中，長出菌落后再接種于麥芽汁培養基中增菌使活菌濃度達到107個/mL，然后取6mL裝入300mL帶濾芯的發酵瓶中，加入200mL麥芽汁于40℃培養48h，每日稱重，記錄每日失重情況，待發酵結束時計算總失重，并對發酵液成分進行分析（可溶性固形物、酒精度、還原糖）。試驗重復3次，復篩得到性狀最為優良的菌株。

1.3.4 紫外線及亞硝酸復合誘變方法

參照劉慶玉等[9]實驗方法進行，菌懸液先用30W紫外線照射處理60s，然后再用濃度為0.2mol/L的亞硝酸處理20min，誘變菌株經培養后，挑取菌落較大且厚的菌株，編號并接入試管斜面保藏，同時取對應的菌株活化后接種至250mL搖瓶中，30℃、180r/min搖床發酵培養48h，對發酵液進行分析并選取優勢菌株。

1.3.5 還原糖的測定

采用DNS法測定[10]。

1.3.6 酒精度的測定

取100mL成熟發酵醪，加入100mL蒸餾水，蒸餾出100mL液體，搖勻后用酒精計和溫度計分別測定其酒精度和溫度，然后查表校正為20℃時的酒精度[11]。

1.3.7 優勢菌株生理特性研究

生長曲線的測定：將篩選出的酵母接種到YPD培養基中，在一定溫度條件下180r/min恒溫搖床培養，每隔2h取一次樣。用分光光度計在波長660nm處，以蒸餾水作空白，測定培養液的OD值。

耐酒精特性：杜氏小管注滿培養基后倒置于盛滿麥芽汁的試管中。滅菌后加入不等量的無水乙醇，制成不同的濃度梯度，接種待測菌株于30℃的條件下培養。10h后測定細胞死亡率。

耐酸堿特性：將酵母種子液接入不同pH值的YPD培養基中，最適生長溫度條件下恒溫培養24h，于波長660nm處測定OD值，確定在不同pH值下的生長情況。

耐高溫特性：將酵母種子液接入YPD培養基中，不同溫度恒溫培養24h，于波長660nm處測定OD值，確定在不同溫度條件下的生長情況。

耐糖性：制備葡萄糖含量分別為10%、20%、35%、40%、50%、60%（w/v）的麥芽汁，滅菌后分別接種酵母菌，35℃培養24h，于波長660nm處測定OD值，判斷菌株對滲透壓的耐受性。

遺傳穩定性實驗：對經過紫外線和亞硝酸誘變篩選出的產酒精能力最高的優勢菌株，進行連續5代傳代培養后測定其產酒率，考察優勢菌株的遺傳穩定性。

2 結果分析

2.1 酵母菌的篩選

本實驗將采集的樣品置于含10%vol乙醇的培養基中，使在含高濃度酒精培養基條件下不生長的菌株被淘汰掉，而能適應的菌株被保留下來，富集及馴化培養的主要目的是使目標菌株能夠適應其生長環境并旺盛生長。TTC是一種顯色劑，對酵母的代謝產物發生呈色反應，通過其可以判斷酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母產酒精能力的高低[12]。顏色深的菌株呼吸酶活力強，有較強的產酒精能力。經過篩選共得到8株產氣較高酵母菌，結果見表1。

表1 TTC篩選酵母結果Table 1 Results of yeast screened by TTC

由表1可看出，TJ-18號酵母產酒精能力較強，達到5.90%vol；殘還原糖約為1.00%，糖利用率較高，且發酵力突出，培養48h，CO2失重為10.4g。故將TJ-18菌作為后續實驗初始菌株。

2.2 紫外線誘變篩選結果

按1.3.4實驗方法，菌懸液先用30W紫外線照射處理60s，培養后選取大且厚菌落，分別標識為UV1～UV10，并同時接種及發酵培養。紫外誘變的結果（表2）可知，經過誘變后，UV-1、UV-6產酒精能力有所減弱，而其他大部分菌株的產酒精能力得到了提升，如UV-2、UV-8、UV-10等菌株酒精產量達到7.00%vol左右，其中UV-8菌株產量最高，達到7.02%vol，相對于出發菌株TJ-18提高了19.0%。紫外線是常用的物理誘變因子，是誘發微生物突變的一種非常有用的工具。UV誘變主要是通過使DNA分子形成嘧啶二聚體，影響堿基配對與正常解鏈，造成基因的突變或死亡，從而提高產酒精能力[13]。

表2 TJ-18菌株紫外誘變后結果Table 2 Results of ultraviolet mutation of TJ-18 strain

2.3 亞硝酸誘變篩選結果

對菌株UV-8再進行亞硝酸誘變處理，由表3可知，經亞硝酸誘變后，酒精的產量進一步提高，主要是紫外線與亞硝酸有較好的協同性。其中菌株UV-N-5的酒精度為8.25%vol，相對于UV-8提高了17.5%，即為本實驗得到的目的菌株。

表3 UV-8菌株經亞硝酸誘變后結果Table 3 Results of nitrite mutation of UV-8 strain

2.4 優勢菌株UV-N-5的生理特性研究

2.4.1 生長曲線的測定

通過微生物生長曲線可以了解優勢降解菌UV-N-5生長繁殖規律。其反映了單細胞微生物在一定環境條件下于液體培養時所表現出的群體生長規律，對于科研和生產都具有重要的指導意義。從圖1可以看出，在0～2h沒有表現出明顯的停滯期，各個溫度下都有不同程度的生長。從4h～10h進入對數生長期，12h后達到穩定期。

圖1 菌種UV-N-5生長曲線Fig.1 Growth curve of strain UV-N-5

2.4.2 耐酒精特性

過高的酒精濃度對酵母有毒性，會抑制細胞的生長及發酵活性。所以，酵母的發酵能力在很大程度上取決于其自身酒精耐受力的大小[14]。酵母菌UV-N-5在麥芽汁中培養，培養溫度為30℃，接種量為1×107個/L，培養時間為10h，測定菌株的死亡率。由圖2可知，在酒精度為20%vol、16%vol、12%vol時，UV-N-5的死亡率分別為50%、43%和34%。在酒精度為8%vol、4%vol，死亡率分別為11%和6%。說明UV-8能耐較高濃度的酒精。可能與其從甜酒糟中篩選出來的有關，這一點從生產上來說是有利的。

圖2 菌種UV-N-5耐酒精特性Fig.2 Alcohol resistant characteristics of strain UV-N-5

2.4.3 耐酸堿特性

圖3 菌株UV-N-5耐酸堿特性Fig.3 Acid and alkali resistant characteristics of strain UV-N-5

耐酸堿實驗結果（圖3）表明，UV-N-5菌能在pH值為3.0～9.0的范圍內正常生長，在pH值為4.5～6.0的范圍內生長旺盛，而這也正是實際生產中的正常pH值范圍，說明了UV-N-5菌可用于實際生產應用。

2.4.4 耐高溫特性

菌株UV-N-5耐高溫實驗結果（圖4）可知，當發酵溫度達到35℃時，該菌的生長狀態達到最佳，之后隨著溫度的升高而降低。但是該菌在溫度40℃時仍保持出很好的耐受性，說明本實驗篩選出的酵母菌的耐熱性憂于之前篩出的菌株。但發酵溫度高于40℃時，該菌的發酵力顯著下降，可能是因為高溫使細胞內酶活降低，細胞膜結構和流動性發生變化，引起酵母早衰、死亡，故高溫對酵母菌的生長和發酵產氣是不利的[15]。

圖4 菌株UV-N-5耐溫特性Fig.4 Temperature resistance characteristic of strain UV-N-5

2.4.5 不同糖質量濃度對UV-N-5生長影響

菌株UV-N-5在不同糖質量濃度中生長情況見圖5，UVN-5在低濃度的葡萄糖中都能較好生長，當糖質量濃度＞10%，酵母菌的生長明顯受到抑制，隨糖質量濃度的增加而抑制酵母菌的增殖。這可能是由于糖質量濃度過高造成滲透壓的增大抑制了酵母菌的增殖。而提高初始糖質量濃度可以提高發酵醪的酒精含量，因此生產用的母菌都需要有一定的滲透壓的耐受能力。從圖5可以看出，當初始糖質量濃度達到40%時，UV-N-5菌的生長變得緩慢。

圖5 不同糖質量濃度對菌種UV-N-5生長影響Fig.5 Effect of different sugar concentration on strain UV-N-5 growth

2.4.6 菌株UV-N-5傳代穩定性研究

對優勢菌株UV-N-5進行連續5次傳代實驗，測定其產酒精能力，由表4可知，發酵后平均產酒精度維持在8.20%vol左右。表現出較好的傳代穩定性。

表4 菌株UV-N-5傳代穩定性實驗結果Table 4 Results of strain UV-N-5 genetic stability test

3 結論

本研究從自然界中分離得到的一株優良的酒精生產菌株TJ-18，發酵酒精度達到5.90%vol，表現出較強的發酵產酒精能力。通過紫外誘變對其進行了改造，其中UV-8菌株產酒精量最高，達到7.02%vol，相對于出發菌株TJ-18提高19.0%。再以UV-8菌株為出發菌株，經亞硝酸誘變后發酵能力進一步提高。使其發酵后的酒精度達到了8.25%vol，比初始菌株TJ-18提高39.83%。同時對優勢菌株UV-N-5進行5次傳代實驗，其產酒精相對穩定，說明其遺傳穩定性較好。

微生物菌種質量的好壞對發酵工業有及其重要的影響，這一研究的技術關鍵在于獲得耐高滲透壓且酒精發酵速率快、耐酒精和耐高溫的酵母菌種，這也是目前研究熱點。通過對復合誘變篩選后UV-N-5菌的生理特性研究，發現在實驗過程中該菌表現出較好的耐高溫、耐糖性及耐酒精特性，但是對具體適合該菌株的培養基質和培養條件有待在后續實驗進一步研究，為其以后作為工業菌應用奠定基礎。

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