乳酸菌發(fā)酵辣椒泡菜工藝的研究

朱海霞，王金菊，李 超，王艷萍*

（天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

近幾十年來，辣椒己成為全世界消費量最大的果蔬之一[1]。千百年來，辣椒泡菜以其脆嫩芳香、酸鮮純正、解膩開胃促消化的功效吸引著國內(nèi)外眾多消費者[2]。目前，辣椒泡菜主要采用自然乳酸發(fā)酵而成，但其發(fā)酵時間長，亞硝酸鹽含量高，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，造成其產(chǎn)品無法工業(yè)化生產(chǎn)。

乳酸菌是一類可發(fā)酵碳水化合物（主要是葡萄糖）產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的通稱[3-4]。乳酸菌作為有益菌群定居在腸道中具有多種保健作用[5]。乳酸菌發(fā)酵食品具有提高酸度、改善風(fēng)味、增加養(yǎng)分、提高營養(yǎng)價值、延長食品保存期、防止腐敗、增強人體免疫力等特點[6]。乳酸菌作為功能性發(fā)酵劑，已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中，如酸奶、干酪、發(fā)酵飲料等[7]。因此，本實驗探究將乳酸菌應(yīng)用于辣椒發(fā)酵工藝中的可行性。通過比較不同蔗糖添加量、接種量、食鹽添加量，考察辣椒總酸度、感官等變化，優(yōu)化發(fā)酵辣椒的工藝，為辣椒泡菜的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒、食鹽、蔗糖等均購于當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

菌種：植物乳桿菌299（Lactobacillus plantarum299）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、德氏保加利亞乳桿菌亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus），保藏于天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院食品生物技術(shù)實驗室。本實驗用于辣椒發(fā)酵的菌懸液按實驗室前期優(yōu)化后最佳菌種比例進行添加，即將植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、保加利亞乳桿菌以1∶2∶1（v/v）的比例進行添加。

1.2 主要儀器與試劑

市售泡菜壇；HFsafe900型超凈工作臺：力新儀器上海有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海柏欣儀器設(shè)備廠；TA.XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀：英國StableMicroSystem公司；DELTA-320 pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；LC-20高效液相色譜儀：日本島津公司。

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，NaAc 5.0g，檸檬酸二銨2.0g，K2HPO42.0g，MgSO40.2g，MnSO40.05g，Tween-80 1.0g，蒸餾水定容至1000mL，pH 6.2～6.4，121℃高壓滅菌20min。

1.3 試驗方法

1.3.1 泡菜的制作工藝

1.3.2 操作要點

裝壇：按1∶1（w/v）的菜水比例，將水注入壇中，加入乳酸菌菌懸液、食鹽、蔗糖充分攪拌溶解后，將辣椒碼放于壇中，使其完全浸沒于水中。

密封：蓋好壇蓋，水封壇沿，避免氧氣及雜菌進入影響辣椒的發(fā)酵。

1.3.3 發(fā)酵辣椒單因素試驗

分別選取不同的蔗糖添加量、接種量、食鹽添加量，按照上述工藝進行發(fā)酵，發(fā)酵周期為9d，考察上述因素對乳酸菌發(fā)酵辣椒的品質(zhì)的影響。試驗因素水平見表1，試驗結(jié)果表示為3次獨立重復(fù)實驗的平均值。

表1 發(fā)酵辣椒試驗單因素水平因素Table 1 Factors and levels of the single factor experiment

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗分析

根據(jù)1.3.3的試驗結(jié)果，以感官評分作為評價標準，對蔗糖添加量、接種量、食鹽添加量進行正交試驗。試驗因素水平見表2，感官指標要求及感官評分權(quán)重見表3。試驗結(jié)果表示為3次獨立重復(fù)試驗的平均值。

表2 發(fā)酵辣椒正交試驗水平因素Table 2 Factors and levels of the orthogonal experiment

表3 感官指標要求及感官評分權(quán)重Table 3 Indicators requirements and evaluation criteria of the sensory

（2）總酸測定

總酸的測定根據(jù)GB/T12456-2008《食品中總酸的測定》中的規(guī)定，采用滴定法，以乳酸計。

（3）質(zhì)構(gòu)分析

將辣椒切成長度1.0cm～1.2cm相同的小塊，進行質(zhì)地剖面分析（texture profile analysis，TPA），試驗條件：P/36R探頭，預(yù)壓速率2mm/s，下壓速率1mm/s，壓后上行速率1mm/s，2次壓縮中間停頓5s，試樣受壓變形為45%，觸發(fā)力值5g。

（4）有機酸分析[8]

有機酸采用高效液相色譜（HPLC）進行測定與分析。

A.樣品的預(yù)處理

5g辣椒汁加入到15mL 0.1%（w/v）的磷酸中，4℃條件下7000g離心10 min，取上清過0.45μm的濾膜，備用。

B.色譜條件

液相色譜儀：島津L710A；色譜柱：Venusil MP C18（5μm，250mm×4.6mm）；柱溫25℃，使用0.1%的磷酸作為流動相，流速為1.0mL/min，紫外檢測波長210nm，進樣量10μL。

C.標準曲線的制作

準確稱取有機酸標準品草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、丙酸，溶解于0.1%的磷酸溶液中。分別以不同濃度進樣檢測，測定不同標準品的出峰時間及其不同濃度對應(yīng)的峰面積，制作標準曲線。

D.樣品測定

將有機酸標準品及預(yù)處理后的樣品分別進行上機檢測，采用外標法計算樣品中有機酸的含量。

（5）亞硝酸鹽檢測

根據(jù)GB5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽測定》中鹽酸萘乙二胺法對亞硝酸鹽進行測定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖添加量對發(fā)酵辣椒的影響

在菜水比為1∶1（w/v）、食鹽添加量4%，接種量為5%的條件下，向泡菜中分別添加0、2%、4%、6%的蔗糖，于20℃～25℃下發(fā)酵9d。考察不同的蔗糖添加量對辣椒發(fā)酵過程中總酸度的影響。試驗結(jié)果見圖1。

1.3.5 檢測指標

（1）pH檢測

直接使用pH計測定辣椒泡菜發(fā)酵液的pH值。

圖1 蔗糖添加量對總酸含量的影響Fig.1 Effect of sucrose content on total acidity

由圖1可以看出，添加蔗糖能加快乳酸菌發(fā)酵辣椒產(chǎn)酸的速度，其中2%～6%的添加量之間無太大區(qū)別。由于現(xiàn)代泡菜產(chǎn)品向增酸、適甜、低鹽的方向發(fā)展[10]，在其生產(chǎn)過程中添加適量的蔗糖，不但可以縮短其發(fā)酵周期，彌補由于乳酸菌代謝產(chǎn)酸而引起的糖分不足，還可以減輕由強烈酸味所帶來的刺激性。但是蔗糖添加量過高，不僅會造成產(chǎn)品生產(chǎn)成本的提高，還會引起產(chǎn)品過高的糖分含量，會影響泡菜的風(fēng)味并限制了產(chǎn)品的消費人群。因此，綜合考慮發(fā)酵產(chǎn)酸速度和產(chǎn)品成本，單因素條件下蔗糖的最佳添加量為2%。

2.2 不同的接種量對發(fā)酵辣椒的影響

在前期試驗結(jié)果基礎(chǔ)之上，接種量分別選取1%、3%、5%、7%、9%5個水平，考察接種量對辣椒發(fā)酵過程中總酸度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同接種量對總酸含量的影響Fig.2 Effect of inoculum on total acidity

接種量對發(fā)酵速度有較大的影響，接種量較低時，發(fā)酵速度緩慢，造成生產(chǎn)周期較長；而隨著接種量的增大，發(fā)酵速度逐漸增加，生產(chǎn)周期縮短，但過大的接種量會造成對發(fā)酵劑的需求量會大大增加，同時由于發(fā)酵速度過快，而不利于風(fēng)味物質(zhì)的形成[11]。因此，選擇合適的接種量，不僅可以縮短發(fā)酵周期，也有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成。由圖2可以看出，接種量為7%～9%時，產(chǎn)酸量的差別不明顯。因此，單因素條件下最佳接種量為7%。

2.3 食鹽添加量對發(fā)酵辣椒的影響

在前期實驗結(jié)果基礎(chǔ)之上，將食鹽的添加量分別選取為2%、4%、6%、8%，考察食鹽添加量對辣椒發(fā)酵過程中總酸度的影響。試驗結(jié)果見圖3。

當(dāng)泡菜發(fā)酵中食鹽添加量過低時，容易滋生腐敗微生物，造成泡菜品質(zhì)下降，并且影響產(chǎn)品風(fēng)味[12]；食鹽添加量過高時，會對乳酸菌的生長產(chǎn)生抑制作用，造成發(fā)酵速度減慢，發(fā)酵周期延長[13]。此外，高鹽濃度下的泡菜產(chǎn)品的口味也難以被廣大消費者接受。由圖3可以看出，當(dāng)食鹽質(zhì)量濃度為2%～4%時，發(fā)酵產(chǎn)酸量隨鹽質(zhì)量濃度的增加而增加；當(dāng)食鹽質(zhì)量濃度高于4%時，發(fā)酵產(chǎn)酸量隨食鹽質(zhì)量濃度的增加而減少，6%的食鹽質(zhì)量濃度已經(jīng)明顯的影響了發(fā)酵產(chǎn)酸量。因此，綜合考慮發(fā)酵速度和產(chǎn)品口感，單因素條件下食鹽的最佳添加量為4%。

圖3 不同鹽質(zhì)量濃度對總酸含量的影響Fig.3 Effect of salt concentration on total acidity

2.4 正交試驗分析確定發(fā)酵辣椒的最佳工藝

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，對發(fā)酵辣椒品質(zhì)有影響的蔗糖添加量、接種量、食鹽添加量3個因素進行L9（33）正交試驗優(yōu)化，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表4 優(yōu)化辣椒泡菜發(fā)酵工藝正交試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for optimal fermentation

表5 辣椒泡菜正交試驗結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of results of orthogonal experiment

由表4及表5可以看出，影響辣椒泡菜因素的主次順序為食鹽添加量＞蔗糖添加量＞接種量，即3個因素中食鹽添加量對辣椒泡菜的影響最大，蔗糖的添加量對辣椒泡菜的影響次之。正交試驗優(yōu)化結(jié)果顯示，辣椒泡菜最佳發(fā)酵工藝為A3B3C2，即蔗糖添加量為3%，接種量為8%，食鹽添加量4%。

2.5 辣椒泡菜的理化性質(zhì)分析

在前期優(yōu)化發(fā)酵工藝基礎(chǔ)之上，對發(fā)酵辣椒的樣品進行理化性質(zhì)的分析。

（1）pH值和總酸的測定

辣椒樣品經(jīng)pH值和總酸的測定，其pH值為3.23，其酸度為1.20%，均可以達到一個很好的程度，達到人們可以接受的范圍，相比較傳統(tǒng)自然發(fā)酵，大大縮短了達到這一程度所需的發(fā)酵時間。

（2）質(zhì)構(gòu)分析

圖4為最優(yōu)條件下的接種發(fā)酵及傳統(tǒng)自然發(fā)酵辣椒的TPA試驗結(jié)果。由圖4可以看出在彈性、粘聚性、硬度、膠著度、咀嚼度、回復(fù)性、粘著性等方面接種發(fā)酵的質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果與自然發(fā)酵相似。接種發(fā)酵在風(fēng)味上接近自然發(fā)酵，在彈性及回復(fù)性上略優(yōu)于自然發(fā)酵。

圖4 自然發(fā)酵和接種發(fā)酵辣椒的TPA試驗結(jié)果Fig.4 TPA results of natural fermentation and inoculated fermentation

（3）有機酸分析

圖5為有機酸標準品的HPLC檢測圖譜，其中其中峰1為草酸，峰2為甲酸，峰3為蘋果酸，峰4為乳酸，峰5為乙酸，峰6為檸檬酸，峰7為琥珀酸，峰8為富馬酸，峰9為丙酸。

根據(jù)標準品的保留時間與含量標準曲線，測得接種發(fā)酵辣椒和自然發(fā)酵辣椒中各有機酸的含量見表6。

有機酸是食品酸味的主要來源食品中有機酸的種類、含量與構(gòu)成對食品的味道有很大影響有機酸不但能夠改善食品的風(fēng)味，還能改變和加強其他風(fēng)味物質(zhì)所產(chǎn)生的味感。檸檬酸產(chǎn)生的是一種令人愉快的、兼有清涼感的酸味，但味覺消失迅速；富馬酸具有水果酸味；蘋果酸產(chǎn)生的是一種特殊愉快的酸味，其酸味的產(chǎn)生和消失都比檸檬酸緩慢；乙酸有較強的刺激味，有強化食欲的功能；琥珀酸兼有海扇和豆醬類的風(fēng)味；乳酸的酸味柔和，有后酸味，可提供柔和的風(fēng)味[14]。

圖5 有機酸標準品高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of normal organic acids

圖6 接種發(fā)酵(a)和自然發(fā)酵(b)辣椒有機酸高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of organic acid of inoculation fermented (a) and natural fermented (b) pepper

圖6（a）、（b）分別為接種發(fā)酵辣椒和自然發(fā)酵辣椒有機酸色譜圖，對比2個圖可以發(fā)現(xiàn)，就有機酸種類而言，接種發(fā)酵辣椒和自然發(fā)酵辣椒無明顯差別，說明接種發(fā)酵辣椒和自然發(fā)酵辣椒在有機酸的組成上非常相似。

根據(jù)標準品的保留時間及含量的標準曲線，測得樣品接種發(fā)酵辣椒與自然發(fā)酵辣椒中有機酸相比較，草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、琥珀酸的有機酸含量差別不大。檸檬酸及丙酸的含量接種發(fā)酵高于自然發(fā)酵，乙酸及富馬酸含量接種發(fā)酵低于自然發(fā)酵，這可能是由于接種發(fā)酵與自然發(fā)酵相比較，微生物菌群及生物量具有差異性，從而引起了接種發(fā)酵與自然發(fā)酵辣椒中有機酸含量存在差異。

表6 有機酸分析結(jié)果Table 6 Organic acids contents of sample

（5）亞硝酸鹽的測定

A.亞硝酸鹽標準曲線

亞硝酸鹽溶液在波長538nm處的標準曲線方程為y=0.0023x+0.0002，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。

B.亞硝酸鹽含量

根據(jù)圖7亞硝酸鹽標準曲線測得乳酸菌發(fā)酵辣椒泡菜的亞硝酸鹽含量為5.5mg/kg。亞硝酸鹽的含量遠低于國家標準GB5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽測定》中的20mg/kg。自然發(fā)酵辣椒泡菜的亞硝酸鹽往往會超出國家標準，亞硝酸鹽產(chǎn)生的主要原因與硝酸還原酶和雜菌的生長繁殖有關(guān)，接種發(fā)酵泡菜可以避免雜菌的生長[15]。此外乳酸菌具有一定的亞硝酸鹽降解能力，所以亞硝酸鹽含量在一個很低的范圍。

圖7 亞硝酸鹽標準曲線Fig.7 The calibration curve of nitrite sodium

3 結(jié)論

綜上所述，乳酸菌發(fā)酵辣椒在菜水比為1∶1的前提下，最佳發(fā)酵工藝為蔗糖添加量為3%，接種量為8%，食鹽添加量為4%，在20℃～25℃發(fā)酵7d～15d。用此方法發(fā)酵辣椒，縮短了發(fā)酵周期；風(fēng)味和質(zhì)地與自然發(fā)酵的辣椒泡菜相似；亞硝酸鹽的含量遠低于國家標準。

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