蛋白激酶5 過度激活誘發β細胞凋亡和調節胰島素分泌的機制研究

鄭亞莉，陸曉華，曹 麗，王 慧，李 博，鄂 靜，保 莉，羅紅艷，蘭曉梅

糖尿病的病理生理機制主要是β細胞數量的減少和功能障礙導致胰島素分泌減少。β細胞的減少在糖尿病發生之前即存在，并貫穿于整個糖尿病發病的始終[1-3]。研究發現,慢性葡萄糖毒性抑制胰島素分泌、胰島素基因表達缺陷及氧化應激可導致β細胞損害和凋亡[4-6]。近期的研究發現細胞周期素依賴的蛋白激酶5(CDK5) 及其激活蛋白p35廣泛存在于胰腺β細胞，可能參與胰島素分泌調節[7]。CDK5的主要激活劑p35主要存在于中樞神經組織，與CDK5結合使其激活，參與神經遞質的分泌并對維持神經元的正常功能發揮重要的作用[8]。由于胰島β細胞與神經元有著共同的外分泌特征[9]，近年來發現高糖環境下、p35表達增高，參與了哺乳動物血糖的調節[10]，但其機制如何，相關研究報道較少。本研究通過采用不同濃度葡萄糖刺激胰島β細胞，觀察p35和其裂解產物p25的表達水平、CDK5活性、胰島素分泌變化以及胰島β細胞的凋亡情況，研究p35在胰島素調節過程中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 CDK5單克隆和多克隆抗體(C-8)、p35多克隆(C-19)抗體購自Santa Cruz公司；一步法cDNA合成試劑盒、Lipofectamine基因轉染試劑購自Invitrogen公司；DMEM培養液購自Gibco公司； DMSO購自Sigma公司；胎牛血清購自Hyclone公司；CDK5、p35、胰島素分泌測定酶標免疫試劑盒購自Linco Research 公司。

1.2 方法 采用不同濃度的葡萄糖(5 mmol/L組、20 mmol/L組和30 mmol/L組)刺激胰島β細胞6 h，收取和固定細胞，行免疫印跡和免疫熒光法測定p35的表達；將p35基因克隆到腺病毒載體中，將p35病毒和空載體病毒(EV)分別轉染到胰島β細胞中(p35組和EV組)，測定p35蛋白表達、CDK5活性及胰島素分泌水平；為進一步證實CDK5活性可以調節胰島素分泌，采用CDK5抑制劑(p35+Ros組)進行抑制試驗；為驗證p25可引起胰島β細胞的損傷，采用細胞凋亡相關抗體Cleaved caspase 3測定胰島β細胞凋亡，具體如下。

1.2.1 細胞培養 Min6小鼠胰島β細胞(由NIH，Dr.Abner Notkins′lab 贈送)。胰島β細胞在含4.5 mg/ml葡萄糖，10%胎牛血清加100 U/ml青霉素G和100 μg/ml鏈霉素的細胞培養皿中培養。

1.2.2 免疫沉淀及CDK5活性測定 用細胞裂解液收取細胞，提取蛋白，BCA法進行蛋白定量分析。取200 μg蛋白加CDK5多克隆抗體(C-8)，在4 ℃中旋轉孵育過夜， 次日加免疫球蛋白(Ig)A瓊脂糖凝膠珠在4 ℃中旋轉孵育4 h，用細胞溶解液洗3次，做免疫印跡或用同位素-32P標記測定酶的活性。

1.2.3 免疫印跡 將提取的蛋白按每道35 μg與上樣緩沖液混合后，上樣到4%～20%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)-PACE凝膠，電泳分離，轉膜到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(100 V,90 min)。用封閉液封閉1 h；一抗反應液(以5 %脫脂奶粉封閉液稀釋,抗CDK5和p35多克隆抗體1∶200)，4 ℃孵育過夜；TBST緩沖鹽溶液漂洗4次,與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)在室溫下孵育1～2 h；TBST緩沖鹽溶液漂洗4次,增強化學發光法(ECL)顯色，X射線底片曝光。

1.2.4 p35和CDK5基因的病毒制備 克隆p35和CDK5 DNA質粒：設計引物，合成；聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，將DNA擴增產物裝入TA載體，做DNA測序。如果測序正常，用EcorV和Not1限制酶消化裝有靶基因的TA載體和pAdTrack-CMV病毒質粒(37 ℃ 水浴，2 h)，然后用DNA連接酶連接靶基因片段和pAdTrack-CMV質粒片斷，獲得pAdTrack-CMV-靶基因病毒質粒。將上述基因病毒質粒轉入HEK239細胞內,48 h后收取細胞及上清液，離心，用凍溶法提取病毒，然后用氯化銫梯度離心純化病毒。病毒轉染濃度滴度檢測找出最佳的轉染濃度。

1.2.5 p35基因病毒轉染和胰島素分泌水平測定 將胰島β細胞鋪板到6孔培養盤(100萬/孔)，在DMEM培養基中培養，其中加10%胎牛血清和100 U/ml青鏈霉素。放在37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養。次日加p35病毒(每孔濃度1 μg/ml)。48 h后收取細胞上清液，使用胰島素分泌測定試劑盒，用免疫酶標方法進行測定分析。

1.2.6 免疫熒光染色 各實驗組細胞(組織切片)用4%甲醛固定30 min,5% BSA/PBS(含0.1% TritonX-100)封閉液封閉30 min，加入用封閉液稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜或室溫下2 h。 然后加入免疫熒光標記的IgG抗體(二抗)在室溫下孵化1 h，然后用PBS洗滌3遍，細胞核用Hoescht 33342染色。使用Zeiss LSM - 510掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光圖像，圖像處理使用Adobe Photoshop。

2 結果

2.1 不同濃度葡萄糖培養的胰島β細胞p35和CDK5的表達 免疫印跡測定，不同濃度葡萄糖培養的胰島β細胞p35的表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)；20 mmol/L組和30 mmol/L組p35的表達較5 mmol/L組升高，30 mmol/L組p35的表達較20 mmol/L組升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。不同濃度葡萄糖培養的胰島β細胞CDK5 的表達比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1、圖1A)。熒光免疫染色顯示高濃度葡萄糖(30 mmol/L)刺激Min6細胞可引起p35表達增高；而CDK5的表達無區別 (圖1B)。

表1 不同濃度葡萄糖培養的胰島β細胞p35和CDK5的表達比較

注：與5 mmol/L組比較，*P<0.05

2.2 不同濃度葡萄糖對胰島β細胞CDK5活性、胰島素分泌的影響 20 mmol/L組和30 mmol/L組胰島β細胞CDK5活性較對5 mmol/L組增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。30 mmol/L組胰島β細胞CDK5活性較20 mmol/L組增高，差異有統計學意義(P<0.05，見圖2A、2B)。20 mmol/L組和30 mmol/L組在刺激6 h較2 h胰島素分泌均降低，差異均有統計學意義(P<0.05，圖2C)。

2.3 高濃度葡萄糖對p35組和EV組p35活性和CDK5活性的影響 p35組p35表達較EV組增高，p35組可見p25條帶(圖3A)，p35組CDK5活性較EV組增高，差異有統計學意義(P<0.05，見圖3B、3C)；p35組胰島素分泌水平較EV組增高，差異有統計學意義(P<0.05，圖3D)。

2.4 p35組、EV組和p35+Ros組細胞凋亡和胰島素分泌情況 p35組細胞凋亡相關抗體Cleaved caspase 3表達較EV組增加，差異有統計學意義(P<0.05)；p35+Ros組細胞凋亡相關抗體Cleaved caspase 3表達明顯較p35組減少，差異有統計學意義(P<0.05)。EV組和p35+Ros組胰島素分泌較p35組增加，差異有統計學意義(P<0.05，見圖4)。

圖2 不同濃度葡萄糖對胰島β細胞CDK5活性、胰島素分泌的影響

Figure2 In different concentrations of glucose environment,CDK5 activityand insulin secretion of islet beta cells

注：A免疫印跡測定，B熒光免疫染色

圖1 不同濃度葡萄糖刺激下p35、CDK5在胰島β細胞中的表達

Figure1 In different concentration of glucose environment,p35,CDK5 expression in islet beta cells

圖3 高濃度葡萄糖對p35組和EV組p35表達和CDK5活性的影響

Figure3 In high concentrations of glucose environment,p35 expression level and CDK5 activity level and insulin secretion in p35 group and EV group

圖4 p35組、EV組和p35+Ros組細胞凋亡和胰島素分泌情況

Figure4 Apoptosis and insulin secretion in P35 group,EV group and p35 +Ros group

3 討論

CDK5是細胞周期素依賴蛋白激酶(CKD)家族的特殊成員，是脯氨酸限制性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于哺乳動物的細胞內[11]。p35和p39是CDK5的激活亞基，生理情況下，CDK5與其激活亞基p35結合形成CDK5/p35復合物而被激活，并通過底物水平磷酸化在神經系統的發育、神經遞質的分泌以及維持神經元正常功能方面發揮著重要的作用[8]。

研究發現，在病理狀態下，如氧化應激、高血糖等環境下，誘導p35分解為p25，形成CDK5/p25復合物，使CDK5處于過度激活狀態，并過度磷酸化某些底物，誘導細胞凋亡，使得機體相應的功能發生障礙，如誘導神經元細胞的凋亡，表現為神經退行性疾病，比如阿爾茨海默病等[11-12]。2型糖尿病與阿爾茨海默病發病有著相似的生理機制，近年來也證實，p35在2型糖尿病患者的胰島β細胞中也有很高的表達，且可以通過激活CDK5的活性，調節胰島素的分泌。Jonas 等[5]發現通過抑制CDK5的活性可以增加胰島素的分泌。這也就提示過度的CDK5激活可能對胰島素的分泌起抑制作用。p35的表達和CDK5的活性變化可能在糖尿病的發病過程中也起著重要的作用，相關研究鮮見報道。

本研究結果首先證實了高濃度的葡萄糖可以增加胰島β細胞p35的表達，且用同位素標記的方法研究發現，高糖情況下，胰島β細胞CDK5的活性明顯增強。而且，此時胰島β細胞分泌胰島素也減少。引起這一結果的機制是否也與其p35的表達增加有關？本研究采用基因克隆和病毒轉染的方法，將p35基因通過病毒轉染到胰島β細胞中，并以轉染空載體病毒為對照， 發現p35組的CDK5活性明顯增強。而且轉染了p35基因的細胞在高糖刺激下可以誘發p25的表達，而在轉染空載體的細胞則無p25的表達，故推測在高糖環境下，p25 的產生引起CDK5過度激活在調節胰島素分泌中發揮重要的作用。進一步采用CDK5抑制劑處理處于CDK5過度激活狀態的胰島β細胞，結果發現： CDK5的活性明顯受到抑制，則更加證明高濃度的葡萄糖是通過增加p35的表達，進而誘發p25的表達，引起CDK5過度活性，從而抑制胰島素分泌。同時也發現，在p25表達的同時伴有胰島β細胞凋亡增加，表明使胰島素的分泌減少是通過增加胰島β細胞的凋亡實現的。相反，在CDK5過度激活的細胞組加入CDK5抑制劑后，則細胞凋亡情況明顯降低，進一步證實CDK5過度激活通過增加胰島β細胞凋亡使胰島素分泌減少。另外也發現，20 mmol/L組和30 mmol/L組與5 mmol/L組比較，僅有p35表達和CDK5活性增加，而沒有CDK5表達增加，說明參與整個病理過程的是CDK5的過度激活而非其表達增加。

總之，本研究發現高濃度葡萄糖是通過增加p35的表達，進而誘發p25的表達，引起CDK5的過度激活，使胰島β細胞凋亡增加，從而抑制胰島素的分泌。這可能是高糖導致胰島β細胞病理狀態下胰島素分泌調節失常的作用機制之一。CDK5過度激活可以通過與各種信號傳導途徑如MAPK、P38、PKC等的互相調節作用增加胰島β細胞凋亡，減少胰島素的分泌；最近的研究發現CDK5/p25活性磷酸化過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)，抑制PPAR-γ的活性從而增加外周組織對胰島素的抵抗[13-14]。因此更多更深入的有關CDK5/p25及其抑制劑在胰島素分泌調節機制研究將為在分子水平尋找治療2型糖尿病的新方法奠定理論基礎。

致謝：感謝美國國立研究院神經疾病及中風研究所Harish C.Pant教授和南方醫院神經內科實驗室主任胡亞芳教授贈送Min6細胞株和腺病毒載體以及在基因病毒構建過程中給予的大力支持和指導！

1 Matveyenko AV,Butler PC.Relationship between beta-cell mass and diabetes onset[J].Diabetes Obes Metab,2008,10(Suppl 4):23-31.

2 金京姬，許玉子，孫明子.糖耐量正常者胰島素敏感性和β細胞功能的研究[J].中國全科醫學，2011，14(12)：4101.

3 周文敬，李卿姬，李素香，等.口服葡萄糖-胰島素釋放試驗者β細胞功能及胰島素敏感性分析[J].中國全科醫學，2011，14(4)：1248.

4 Kaneto H,Kawamori D,Matsuoka TA,et al.Oxidative stress and pancreatic beta-cell dysfunction[J].Am J Ther,2005,12(6):529-533.

5 Jonas JC,Bensellam M,Duprez J,et al.Glucose regulation of islet stress responses and beta-cell failure in type 2 diabetes[J].Diabetes Obes Metab,2009,11(Suppl 4):65-81.

6 Andrali SS,Sampley ML,Vanderford NL,et al.Glucose regulation of insulin gene expression in pancreatic beta-cells[J].Biochem J,2008,415(1):1-10.

7 Wei FY,Nagashima K,Ohshima T,et al.Cdk5-dependent regulation of glucose-stimulated insulin secretion[J].Nat Med,2005,11(10):1104-1108.

8 Hisanaga S,Saito T.The regulation of cyclin-dependent kinase 5 activity through the metabolism of p35 or p39 Cdk5 activator[J].Neurosignals,2003,12(4/5):221-229.

9 Li L,Holscher C.Common pathological processes in Alzheimer disease and type 2 diabetes:a review[J].Brain Res Rev,2007,56(2):384-402.

10 Ubeda M,Rukstalis JM,Habener JF.Inhibition of cyclin-dependent kinase 5 activity protects pancreatic beta cells from glucotoxicity[J].J Biol Chem,2006,281(39):28858-28864.

11 Dhavan R,Tsai LH.A decade of CDK5[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2(10):749-759.

12 Patrick GN,Zukerberg L,Nikolic M,et al.Conversion of p35 to p25 deregulates Cdk5 activity and promotes neurodegeneration[J].Nature,1999,402(6762):615-622.

13 Choi JH,Banks AS,Estall JL,et al.Anti-diabetic drugs inhibit obesity-linked phosphorylation of PPARgamma by Cdk5[J].Nature,2010,466(7305):451-456.

14 Doshi LS,Brahma MK,Bahirat UA,et al.Discovery and development of selective PPAR gamma modulators as safe and effective antidiabetic agents[J].Expert Opin Investig Drugs,2010,19(4):489-512.