接合物蛋白在甲狀腺乳頭狀微小癌中的表達及其臨床意義

楊香山，程紹梅，郭京艷，李成軍，李愛萍，韓 琳

近年來，甲狀腺乳頭狀微小癌的發病率逐漸增高且發病機制及術式選擇日漸受到關注。甲狀腺乳頭狀微小癌的發生與多種因素有關，如環境因素、癌基因等。接合物蛋白(CRKL)作為CRK(CT10 regulator of kinase)家族的成員之一，通過SH2結構域和SH3結構域與多種信號分子結合形成復合物，將信號傳遞給下游，通過多條信號途徑參與腫瘤發生發展[1]。然而，CRKL在甲狀腺乳頭狀微小癌中的表達國內外報道較少，本研究采用免疫組織化學(SP)技術檢測甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺乳頭狀微小癌、結節性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中CRKL的表達，通過對比CRKL的表達差異，探討CRKL在甲狀腺乳頭狀微小癌中的臨床意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集山東省醫學科學院附屬醫院2008—2013年經手術治療的50例直徑>1 cm的甲狀腺乳頭狀癌患者、50例甲狀腺乳頭狀微小癌患者、50例結節性甲狀腺腫患者、50例正常者甲狀腺組織的石蠟標本。甲狀腺乳頭狀癌組：男13例，女37例；年齡16～76歲，中位年齡44歲，其中≤45歲31例，>45歲19例；有頸淋巴結轉移36例，無頸淋巴結轉移14例；均行手術并經病理證實；術前均無化療、放療及免疫治療史。甲狀腺乳頭狀微小癌組：男6例，女44例，年齡22～68歲，中位年齡45歲，其中≤45歲22例，>45歲28例；有頸淋巴結轉移27例(伴甲狀腺被膜浸潤8例)，無頸淋巴結轉移23例(均無甲狀腺被膜浸潤)；均行手術并經病理證實；術前均未行其他治療。結節性甲狀腺腫組：男15例，女35例，年齡19～68歲，中位年齡42歲；單發20例，多發30例；均行手術并經病理證實，術前均未合并其他疾病。正常甲狀腺組織組：男9例，女41例；年齡21～66歲，中位年齡42歲；均隨機選自甲狀腺乳頭狀癌以及甲狀腺乳頭狀微小癌患者的癌旁正常組織，均經山東省醫學科學院附屬醫院病理科兩名醫生確診為正常組織；術前均未合并其他疾病。

1.2主要試劑小鼠抗人CRKL單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗、多聚物輔助試劑與二氨基聯苯胺(DAB)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3SP染色方法以Santa Cruz公司提供的CRKL表達陽性的切片作為陽性對照，磷酸鹽(PBS)緩沖液作為陰性對照。石蠟標本常規切片、脫蠟、水化、過氧化氫(H2O2)去除組織過氧化物酶，抗原修復15 min；PBS沖洗5 min/次，共3次，加入山羊血清封閉20 min，加入小鼠抗人CRKL 4 ℃過夜；PBS沖洗，加入多聚物輔助試劑孵育15 min；PBS沖洗，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗孵育20 min；DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片，在光學顯微鏡下觀察染色情況。陽性表達時細胞質呈棕黃色片狀或顆粒狀，根據陽性細胞分布情況，每張切片選取5個不同的視野，采用Image Pro Plus圖像分析系統計算CRKL表達平均吸光度(MOD)。

1.4Western blotting實驗按常規方法提取組織總蛋白，BCA蛋白定量后，每道加入50 μg蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉后加入CRKL兔抗人抗體(1∶500)，4 ℃過夜。TBST溶液洗膜，GAPDH作為內參，加入辣根過氧化物酶結合的二抗。ECL化學發光試劑盒檢測。Quantity one分析蛋白條帶灰度值。以目的條帶灰度值與對應的GAPDH灰度值之比作為蛋白水平的定量指標。

2　結果

2.1CRKL在不同甲狀腺組織中的表達情況CRKL在甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺乳頭狀微小癌細胞的胞膜與胞質陽性表達，呈淺黃色-棕褐色細顆粒狀(見圖1、2)；CRKL在結節性甲狀腺腫的部分細胞中表達，呈淺黃色-棕褐色細顆粒狀(見圖3)；正常甲狀腺組織細胞幾乎未見染色(見圖4)。

甲狀腺乳頭狀癌組、甲狀腺乳頭狀微小癌組、結節性甲狀腺腫組及正常甲狀腺組織組中CRKL的表達陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中甲狀腺乳頭狀癌組、甲狀腺乳頭狀微小癌組高于結節性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組織組，差異均有統計學意義(P<0.05)。4組中CRKL表達的MOD比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中甲狀腺乳頭狀癌組、甲狀腺乳頭狀微小癌組高于結節性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組織組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2CRKL表達量與甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺乳頭狀微小癌臨床病理特征的關系CRKL表達量與甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺乳頭狀微小癌患者年齡、性別、病灶數目均無關(P>0.05)；與有無侵犯被膜、有無頸淋巴結轉移有關(P<0.05，見表2)。

表1　不同甲狀腺組織中CRKL表達陽性率及表達量比較

注：▲為F值；與結節性甲狀腺腫組比較，*P<0.05；與正常甲狀腺組織組比較，△P<0.05；MOD=平均吸光度

Table2Correlation between expression of CRKL and clinical pathological data of patients with thyroid papillary or carcinoma thyroid papillary micro-carcinoma

甲狀腺乳頭狀癌例數　　MOD　　　t值　P值甲狀腺乳頭狀微小癌例數　　MOD　　　t值　P值性別1 52>0 051 89>0 05　男130 498±0 22160 501±0 281　女370 558±0 230440 543±0 221年齡(歲)0 89>0 051 68>0 05　<45310 523±0 192220 512±0 169　≥45190 562±0 215280 551±0 102病灶數目1 63>0 051 96>0 05　單發320 576±0 246240 533±0 157　多發180 521±0 198260 519±0 235侵犯被膜6 09<0 015 68<0 01　有110 679±0 12180 702±0 092　無390 495±0 104420 486±0 152頸淋巴結轉移8 12<0 017 53<0 01　有360 739±0 118270 764±0 085　無140 286±0 098230 325±0 134

圖1CRKL在甲狀腺乳頭狀癌陽性表達 (SP，×200)

圖2CRKL在甲狀腺乳頭狀微小癌陽性表達 (SP，×200)

圖3CRKL在結節性甲狀腺腫陽性表達 (SP，×200)

圖4CRKL在癌旁正常組織陰性表達 (SP，×200)

Figure1Positive expression of CRKL in thyroid papillary carcinoma

Figure2Positive expression of CRKL in thyroid papillary micro-carcinoma

Figure3Positive expression of CRKL in nodular goiter

Figure4Negative expression of CRKL in normal tissues adjacent to thyroid papillary carcinoma

2.3Western blotting實驗檢測CRKL在甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺乳頭狀微小癌組織的表達甲狀腺乳頭狀癌組與甲狀腺乳頭狀微小癌組CRKL含量均高于正常甲狀腺組織組；甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺乳頭狀微小癌轉移組的CRKL含量均高于未轉移組(見圖5、6)。

圖5CRKL在正常甲狀腺組織及甲狀腺乳頭狀癌未轉移組、轉移組中的表達情況

Figure5Expression of CRKL in tissues adjacent to thyroid papillary carcinoma,carcinoma tissues without metastasis and carcinoma tissues with metastasis

圖6CRKL在正常甲狀腺組織及甲狀腺乳頭狀微小癌未轉移組、轉移組中的表達情況

Figure6Expression of CRKL in tissues adjacent to thyroid papillary micro-carcinoma,carcinoma tissues without metastasis and carcinoma tissues with metastasis

3　討論

甲狀腺乳頭狀癌是頭頸部最常見的內分泌腺惡性腫瘤，盡管生長相對緩慢，但極易發生早期頸淋巴結轉移，部分患者在晚期發生遠處轉移，如轉移到肺、骨和腦等，嚴重影響患者的生存。甲狀腺乳頭狀微小癌是甲狀腺乳頭狀癌的一種亞型，直徑在1 cm以下，但仍具有腺內與腺外侵襲性及頸部淋巴結或遠處轉移的特性。

本研究結果顯示，直徑>1 cm的甲狀腺乳頭狀癌及甲狀腺乳頭狀微小癌組織中CRKL表達的MOD高于結節性甲狀腺腫和正常甲狀腺組織。已有研究表明，CRKL在乳腺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤中呈過度表達[2-5]，且與患者預后、腫瘤惡化緊密相關,本研究與此相符。

CRKL是CRK家族成員之一，是整合素介導的信號途徑的下游分子之一，其結構中含有一個SH2結構域和兩個呈串聯排列的SH3結構域。CRKL中SH2結構域與上游酪氨酸磷酸化的Cas、CasL、HEFl、BCR/Cbl等信號分子結合，而N端的SH3結構域與下游富含脯氨酸的Dockl80、C3G、Sos、ABL和P13K等信號分子結合形成“黏著斑”復合物[5-7]，從而將信號通過Dockl 80傳遞給Racl，刺激細胞層狀邊緣和細胞膜波動緣的形成，可促進細胞運動、增殖及分化[8]。去磷酸化的CRKL可激活C3G[9]，C3G促進Rapl與GDP分離，使其與GTP結合，從而使Rapl無活性的GDP結合形式轉變為有活性的GTP結合形式，再通過MAPK途徑亦可促進細胞運動、增殖及分化。CRKL蛋白可能通過整合信號通路增加腫瘤細胞的運動和浸潤，促進甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、分化、遷移，進而影響甲狀腺乳頭狀癌的發生發展。由此推測可以通過拮抗或沉默CRKL蛋白的表達及阻斷其信號通路中的蛋白分子來阻止甲狀腺乳頭狀癌的發生和發展。

本研究結果顯示，CRKL在甲狀腺乳頭狀微小癌和甲狀腺乳頭狀癌中表達無差異，但CRKL表達與甲狀腺乳頭狀微小癌和甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結轉移、侵犯被膜均有關系，提示二者可能具有相同的生物學特性。甲狀腺乳頭狀癌早期經淋巴結轉移，而對于甲狀腺乳頭狀癌的手術方式，國外學者建議應行預防性頸淋巴結清掃術[10]。由于甲狀腺乳頭狀微小癌也經頸淋巴結轉移，故在治療方面二者可以采用相同的手術方式，對甲狀腺乳頭狀微小癌也應行頸部淋巴結清掃。

總之，CRKL的表達可以作為潛在的靶點用于甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺乳頭狀微小癌等的治療[11]；另外，CRKL與甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺乳頭狀微小癌頸淋巴結轉移、被膜侵犯密切相關，更為臨床頸淋巴結清掃奠定了理論基礎。

1翟波，廖侃.接頭蛋白c-Crk的結構和功能[J].生命的化學，2003，23(3)：198-201.

2Fathers KE,Rodrigues S,Zuo D,et al.CrkⅡ transgene induces atypical mammary gland development and tumorigenesis[J].Am J Pathol,2010,176(1):446-460.

3沈太敏，趙純全，趙涌，等.接合物蛋白Crk和CrkL在上皮性卵巢癌中的表達及意義[J].中國全科醫學，2008，11(6)：940-942.

4Cheung HW,Du J,Boehm JS,et al.Amplification of CRKL induces transformation and epidermal growth factor receptor inhibitor resistance in human non-small cell lung cancers[J].Cancer Discov,2011,1(7):608-625.

5Jano?tiak R,Tolde O,Bruhová Z,et al.Tyrosine phosphorylation within the SH3 domain regulates CAS subcellular localization,cell migration,and invasiveness[J].Mol Biol Cell,2011,22(22):4256-4267.

6Zheng J,Machida K,Antoku S,et al.Proteins that bind the Src homology 3 domain of CrkⅠ have distinct roles in Crk transformation[J].Oncogene,2010,29(48):6378-6389.

7Watanabe T,Tsuda M,Tanaka S,et al.Adaptor protein Crk induces Src-dependent activation of p38 MAPK in regulation of synovial sarcoma cell proliferation[J].Mol Cancer Res,2009,7(9):1582-1592.

8Wang H,Linghu H,Wang J,et al.The role of Crk/Dock180/Rac1 pathway in the malignant behavior of human ovarian cancer cell SKOV3[J].Tumour Biol,2010,31(1):59-67.

9Cheung HW,Du J,Boehm JS,et al.Amplification of CRKL induces transformation and epidermal growth factor receptor inhibitor resistance in human non-small cell lung cancers[J].Cancer Discov,2011,1(7):608-625.

10Chisholm EJ,Kulinskaya E,Tolley NS.Systematic review and meta-analysis of the adverse effects of thyroidectomy combined with central neck dissection as compared with thyroidectomy alone[J].Laryngoscope,2009,119(6):1135-1139.

11Natsume H,Shinmura K,Tao H,et al.The CRKL gene encoding an adaptor protein is amplified,overexpressed,and a possible therapeutic target in gastric cancer[J].J Transl Med,2012(10):97.