高原低氧環(huán)境下結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在正常和不同病變胃黏膜中的表達(dá)

祁永清，李菊英，賀菊香，王海燕

胃腸道是對(duì)氧較敏感的器官,低氧環(huán)境引起唾液腺分泌減少,參與消化的腸淀粉酶亦減少,這影響到高原人消化吸收功能,也是高原地區(qū)慢性胃炎,尤其是慢性萎縮性胃炎高發(fā)原因之一。胃癌是高原地區(qū)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著本地區(qū)居民的生命健康，為探討在高原低氧環(huán)境下不同病變胃黏膜組織中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的陽(yáng)性表達(dá)，早期診斷胃黏膜的不同病變，為胃癌的預(yù)防及早期診斷提供理論依據(jù)，本研究觀察了青海高原地區(qū)患有慢性萎縮性胃炎及胃癌患者的病變胃黏膜和正常胃黏膜中CTGF的表達(dá)情況,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2007年7月—2008年3月青海大學(xué)附屬醫(yī)院行胃鏡檢查并符合慢性萎縮性胃炎的患者20例，鉗取2～4塊，中性固定液固定，經(jīng)病理確診并資料完整，其中男10例，女10例；年齡28～74歲，平均(47.3±8.0)歲。均未接受過(guò)治療。慢性萎縮性胃炎的診斷參考2006年中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)[1]，分為慢性萎縮性胃炎腸上皮化生12例和非化生性慢性萎縮性胃炎8例。另收集同時(shí)期青海大學(xué)附屬醫(yī)院送檢病理科的胃癌切除標(biāo)本50例，其中男41例，女9例；年齡35～80歲，平均(55.7±4.0)歲。均經(jīng)病理證實(shí)為胃癌，高分化8例，中分化15例，低分化27例。取同時(shí)期體檢時(shí)行胃鏡檢查的健康者10例，并在本人自愿情況下鉗取2～4塊正常胃黏膜,其中男7例，女3例；年齡35～70歲，平均(51.8±5.0)歲。

1.2 主要試劑 鼠抗人多克隆CTGF濃縮型工作液購(gòu)自美國(guó)R&D system corporation,HistostainTM-plus kits 試劑盒工作濃度比例1∶10，濃縮型DAB顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)和檸檬酸抗原修復(fù)液均購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.3 方法 所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4 μm，切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水，用0.01 mol/L pH值7.2 的PBS漂洗3次，5 min/次，擦干組織周圍的水分，加3%過(guò)氧化氫(H2O2)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫10 min，PBS洗3次，5 min/次，切片放入0.01 mol/L檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中高壓間接抗原修復(fù)10 min，室溫冷卻，PBS洗3次，5 min/次，加一抗，4 ℃冰箱過(guò)夜。PBS洗3次，5 min/次，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗37 ℃溫箱1 h，PBS洗3次，5 min/次，新鮮配制的二氨基聯(lián)苯氨(DAB)顯色液進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染，逆梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判讀，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%為(+),25%～50%為(++),>50%為(+++),無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞(-)。(+～+++)為陽(yáng)性表達(dá)，(-)為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料多組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間兩兩比較檢驗(yàn)水準(zhǔn)α′=0.0083。

2 結(jié)果

2.1 CTGF在不同胃黏膜的光學(xué)顯微鏡表現(xiàn) 正常胃黏膜中，胃腺排列整齊，形態(tài)規(guī)則，CTGF在大多細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)，只散在表達(dá)在胃小凹腺體頸部細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜中(見(jiàn)圖1)。慢性萎縮性胃炎中，胃腺體數(shù)量減少、胃小凹變淺，CTGF彌漫表達(dá)(見(jiàn)圖2)。胃癌組織中CTGF彌漫表達(dá)，且染色較深(見(jiàn)圖3)。

圖1 正常胃黏膜CTGF的陽(yáng)性表達(dá)(×40)

圖2 慢性萎縮性胃炎CTGF的陽(yáng)性表達(dá)(×40)

圖3 胃癌組織中CTGF的陽(yáng)性表達(dá) (×40)

2.2 CTGF在不同胃黏膜的表達(dá) 正常胃黏膜中CTGF陽(yáng)性表達(dá)1例(1/10)；慢性萎縮性胃炎腸上皮化生組織中CTGF陽(yáng)性表達(dá)11例(11/12)；非化生性慢性萎縮性胃炎組織中CTGF陽(yáng)性表達(dá)4例(4/8)；胃癌組織中CTGF陽(yáng)性表達(dá)32例(64%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.097,P=0.0011)。慢性萎縮性胃炎腸上皮化生、胃癌組織中CTGF陽(yáng)性表達(dá)率較正常胃黏膜中升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為14.673和9.818，P值分別為0.0001和0.0017)。慢性萎縮性胃炎腸上皮化生、非化生性慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中CTGF陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.0083)。

3 討論

對(duì)青海地區(qū)正常胃黏膜和不同病變胃黏膜研究發(fā)現(xiàn)：在正常胃黏膜組織中CTGF只表達(dá)在胃小凹頸部細(xì)胞的胞質(zhì)中，在慢性萎縮性胃炎腸上皮化生組織中CTGF彌漫表達(dá)，與正常胃黏膜比較差異明顯。胃癌組織中CTGF亦呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與正常胃黏膜比較差異明顯，但與慢性萎縮性胃炎沒(méi)有明顯差異，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[2]，但發(fā)生的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤前列。早診斷、早治療是目前提高胃癌患者生存率的惟一有效措施。臨床胃鏡活組織檢查的廣泛應(yīng)用使早期胃癌的診斷成為可能。但臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，胃鏡活組織檢查技術(shù)對(duì)早期胃癌的檢查率并無(wú)很大提高，大部分胃癌患者診斷時(shí)已屬于晚期，其主要原因可能與對(duì)胃癌前期變化認(rèn)識(shí)不夠充分、不能為臨床提供可靠的胃黏膜癌前病變隨訪資料有關(guān)。為了對(duì)胃癌的早期診斷提供可靠的理論依據(jù)，本研究探討青海高原地區(qū)患有慢性萎縮性胃炎及胃癌患者的病變胃黏膜組織和正常胃黏膜組織中CTGF的表達(dá)情況，在慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化組織中，如果CTGF表達(dá)陽(yáng)性，一定要引起高度警惕，積極有效治療的同時(shí)要密切注意胃黏膜改變。但本研究中由于例數(shù)較少，不排除出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能，在以后的研究中應(yīng)加大樣本進(jìn)一步證實(shí)。

CTGF是20世紀(jì)90年代初在血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)的誘導(dǎo)下從人臍周靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)中首次發(fā)現(xiàn)的，可由成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞合成分泌。 CTGF屬于即刻早期生長(zhǎng)反應(yīng)性基因，定位于許多細(xì)胞的細(xì)胞核中，它與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、黏附、胚胎發(fā)育以及傷口愈合等有關(guān)[1]；是一種功能的分泌蛋白，在不同的腫瘤所起的作用有所不同[3]。在成人結(jié)締組織、心、腦、腎[4]、肺[5]、肝、肌肉、胰腺以及胎盤等組織都有CTGF的表達(dá)。同時(shí)多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)除了正常生理表達(dá)之外，在人類一些疾病中，如在黑色素瘤[6]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[7]和一些良惡性腫瘤等疾病中CTGF均有不同程度的表達(dá)，與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。有資料顯示，結(jié)腸癌黏膜CTGF表達(dá)比正常結(jié)腸高，而且與分化程度有關(guān)，在低分化結(jié)腸癌中高表達(dá)[8]。在膽囊癌中CTGF比膽囊炎、正常膽囊黏膜中表達(dá)高[9]。本研究提示如果在胃鏡鉗取的胃黏膜組織中檢測(cè)出CTGF，可能對(duì)胃癌的早期診斷有很大的幫助，所以CTGF的檢測(cè)可以用于胃癌的癌前病變的篩選，不僅可以提高對(duì)胃癌發(fā)病的認(rèn)識(shí)，而且對(duì)胃癌的預(yù)防有實(shí)際意義。高原環(huán)境具有氧分壓低、紫外線強(qiáng)、氣候多變等特點(diǎn),是一個(gè)特殊的生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)。高原低氧引起胃腸功能紊亂，胃腸蠕動(dòng)減慢，胃排空時(shí)間延長(zhǎng)，胃內(nèi)容物滯留，易引起胃黏膜病變，文獻(xiàn)報(bào)道高原地區(qū)慢性胃炎發(fā)病率高，且海拔越高，發(fā)病率越高[10]?？紤]其原因與長(zhǎng)期處于高原缺氧環(huán)境，造成急性胃炎的上述因素持續(xù)存在有關(guān)。慢性萎縮性胃炎又是癌前病變,胃癌的發(fā)生被認(rèn)為是從胃黏膜炎癥開(kāi)始的一個(gè)逐漸累積的過(guò)程，隨著病變的發(fā)展，在組織學(xué)上逐步發(fā)展成癌前病變，最后演變形成胃癌[11]。本研究探討了高原地區(qū)CTGF在不同胃黏膜病變中的表達(dá)情況，為預(yù)防和減少本地區(qū)胃癌的發(fā)病，探討胃癌發(fā)病的病因，尋找最有效的診斷途徑提供了依據(jù)。

1 張彥亮，倪海濱.結(jié)締組織生長(zhǎng)因子與相關(guān)疾病的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè),2002,24(3):190-193.

2 Liu LY,Han YC,Wu SH,et al.Expression of connective tissue growth factor in tumor tissues is an independent predictor of poor prognosis in patients with gastric cancer [J].World Journal of Gastroenterology,2008,14(13): 2110-2114.

3 Chang CC,Hsu WH,Wang CC,et al.Connective tissue growth factor activates pluripotency genes and mesenchymal-epithelial transition in head and neck cancer cells[J].Cance Res,2013,73(13):4147-4157.

4 趙慧娟，孫東立，張林霞，等.藥物干預(yù)對(duì)IgA腎病患者尿液中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子水平的影響及臨床意義[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010，13(11)：3754.

5 閆慧明，丁利芳，劉媛，等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1與結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎合并肺間質(zhì)病變患者血清中的表達(dá)水平及臨床意義[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2012，15(10)：3268.

6 Finger EC,Cheng CF,Williams TR,et al.CTGF is a therapeutic target for metastatic melanoma[J].Onconege,2013,25(5):1038-1042.

7 Wang JG,Ruan J,Li CY,et al.Connective tissue growth factor,a regulator related with 10-hydroxy-2-decenoic acid down-regulate MMPs in rheumatoid arthritis[J].Rheumatol Int，2012,32(9):2791-2799.

8 Sun Z,Yang P,Liang LY,et al.Expression of connective tissue growth factor in colorectal cancer and its association with prognosis[J].Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi,2012,15 (11): 1166-1170.

9 Garcia P,Leal P,Alvarez H,et al.Connective tissue growth factor immunohistochemical expression is associated with gallbladder cancer progression[J].Ach Pathol Lab Med,2013,137(2):245-250.

10 熊元志.重視慢性高原病胃黏膜病變的臨床研究[J].國(guó)內(nèi)講堂,2008,12(10):20-23.

11 王萍,高柳成.胃鏡檢查胃粘膜腸上皮化生相關(guān)因素的臨床分析[J].北京醫(yī)學(xué),2007,24(12)：753.