RNA干擾沉默信號轉導和轉錄激活因子3對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞增殖的影響

王亞媛，高 薇，王 燕，馮 欣

類風濕關節炎 (rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性疾病，以滑膜增生和外周關節對稱性、侵蝕性關節炎為主要特征，是一種慢性系統性自身免疫性疾病。RA早期主要表現為關節的紅腫熱痛以及功能障礙，最終可能會導致關節的畸形甚至患者的殘疾。它不僅患病率高，而且致殘率亦高，是造成人群勞動力喪失的主要疾病之一。其病因與發病機制，即在RA中炎癥和關節損害是如何發展和慢性持續的仍舊是未知的。但是已經有相關研究表明信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在RA的發病過程中會有持續表達，造成滑膜的持續性炎癥。然而目前尚無理想的治療手段，因此進一步尋找治療RA的有效方法是亟待解決的難題。

本實驗通過構建靶向STAT3的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉染進入人RA成纖維樣滑膜細胞 (fibroblast－like synoviocytes，FLS)，從而觀察FLS的一系列生理變化、轉染的效率及其抑制率，從而為下一步實施動物造模實驗提供理論依據，進一步揭示STAT3在RA發病中的作用，為未來RA的基因治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 滑膜組織 本實驗用的滑膜組織由遼寧醫學院附屬第一醫院骨關節科提供，患者為2012年2—12月行關節鏡滑膜切除的RA患者，診斷均符合1987年美國風濕病學會 (ARA)修訂的RA的診斷標準。術前獲得患者知情同意。

1.2 主要試劑 DMEM高糖培養基和胎牛血清購自Hyclone公司;Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶均購自Sigma公司;Trizol和LipofectamineTM2000轉染試劑盒均購自美國Invitrogen公司;聚合酶鏈反應 (PCR)引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成，反轉錄聚合酶鏈反應 (RT－PCR)試劑盒購自寶生物工程 (大連)有限公司;兔抗人STAT3抗體、羊抗兔抗體(二抗)均購自Santa Cruz公司;靶向STAT3的siRNA干擾質粒由上海吉凱基因化學技術有限公司設計構建，共有3個干擾靶序列，分別為 stat3－siRNA－1:5'－TGACCAACAATCCCAAGAA－3';stat3－siRNA－2:5'－ACAATCTACGAAGAATCAA－3';stat3－siRNA－3:5'－TGAAATCATCATGGGCTAT －3'。

1.3 方法

1.3.1 RA FLS的培養 在無菌條件下取滑膜組織，用磷酸鹽緩沖液 (PBS)反復沖洗4～5次以去除血污，剔除周圍的脂肪組織。然后用眼科剪子將滑膜組織切割為1～2 mm3的小塊，用Ⅱ型膠原酶終濃度為0.4%的DMEM培養基，于37℃5%二氧化碳 (CO2)培養箱中孵育消化2 h，然后以1 000 r/min(離心半徑為13.8 cm)離心5 min，收集細胞，棄掉上清液，加入0.25%胰蛋白酶4 ml，再于37℃ 5%CO2培養箱中消化30 min。用200目紗網過濾后離心，棄上清液。用10%胎牛血清－DMEM培養基重懸細胞，移入培養瓶內，置于37℃ 5%CO2培養箱內培養24 h后更換培養液，棄去未貼壁細胞。此時，貼壁的細胞即為原代FLS。待FLS達80%匯合成片時，消化傳代，本實驗用3～7代的細胞。

1.3.2 siRNA轉染細胞 轉染前將2×105個FLS接種于96孔培養皿中，待細胞融合達到80%～90%。按照Invitrogen公司的LipofectamineTM2000轉染試劑操作說明書進行轉染操作。轉染后10～12 h換為10%胎牛血清－DMEM培養基。本實驗細胞分為5組:空白組 (正常培養的FLS)、陰性對照組 (即加入空白質粒的FLS)、RNAi－1組、RNAi－2組和RNAi－3組，后3個組均加入靶向siRNA的重組質粒，即stat3－siRNA干擾，分別針對3個不同的靶點。按照分組情況，分別于FLS轉染后的24、48、72 h在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染細胞綠色熒光的表達，按發生綠色熒光的細胞數占細胞總數的比例來估計其轉染效率。

1.3.3 轉染后RT－PCR檢測靶基因的mRNA表達水平 根據STAT3的3個等位基因同源區設計其引物，上游為5'－CTACAGTGACAGCTTCCCAATG －3'，下游為5'－TTGGCTTCTCAAGATACCTGCT－3'，擴增產物長度為233 bp。用 Trizol提取各組細胞總RNA，按RT－PCR試劑盒說明，取RNA樣品進行反轉錄以及PCR擴增。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后使用凝膠成像系統進行條帶分析，測出各組表達率 (即各條帶的灰度值/β－actin條帶灰度值×100%)，然后計算抑制率(抑制率 =1－表達率)。反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性50 s;54℃退火50 s;72℃延伸1 min;擴增34個循環;最后72℃延伸8 min。取反應液5 μl進行電泳。

1.3.4 免疫印跡 (Western blotting)法檢測干擾后STAT3的表達 將細胞裂解，提取各組細胞的總蛋白質，蛋白定量并制樣。將樣品加入制備好的10%聚丙烯酰胺凝膠 (SDS－PAGE)中，電泳分離蛋白質。分離的蛋白質經電泳轉移至聚偏二氟乙烯膜 (PVDF)后，用5%的脫脂奶粉封閉2 h后加入兔抗人STAT3抗體 (1∶500)，4℃搖床孵育過夜。洗膜后以1∶1 000稀釋的相應的堿性磷酸酶標記的二抗室溫孵育2 h，再用TBST洗3次，5 min/次。最后進行增強化學發光法 (ECL)顯色，以各組電泳條帶的灰度值作為條帶的強度指標，內參照β－actin表達條帶的灰度值作為標準，二者的比值代表各組STAT3的表達率，然后根據1－表達率得到表達抑制率。

1.3.5 四甲基偶氮唑藍 (MTT)法檢測靶向抑制STAT3對FLS增殖的影響 取對數生長期的人FLS接種于96孔板，每孔104個細胞。每板分3組，每組10孔，共接種5板。第1組為空白組，第2組為陰性對照組，第3組為轉染后確定的最佳干擾序列組 (RNAi－1組)，即RNAi組。5個板分別于接種后培養24、48、72、96、120 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，37℃溫箱繼續孵育4 h，離心后棄去培養基，每孔加入100 μl二甲基亞砜 (DMSO)，室溫下避光震蕩孵育10 min，使結晶充分溶解，用酶標儀測量各孔490 nm處的吸光度 (A)值，間接反映活細胞數量，以此作為觀察FLS增殖情況的指標。以時間為橫軸、A為縱軸繪制增殖曲線。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計檢驗。計量資料以 ((±s)表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 stat3－siRNA對RA FLS的轉染效率 轉染后在倒置熒光顯微鏡下可以觀察到，被轉染的細胞有綠色熒光表達，而未被質粒轉染的細胞則沒有熒光表達。其中在轉染48 h時熒光表達較強，轉染細胞數量最多，72 h后熒光表達開始減弱。

2.2 轉染后STAT3 mRNA的表達情況 RT－PCR分析結果見圖1。在轉染RA FLS后，空白組、陰性對照組、RNAi－1組、RNAi－2組和RNAi－3組STAT3 mRNA表達抑制率分別為(27.32±2.06)%、 (30.61±2.47)%、 (76.99±2.05)%、(72.75±1.74)%和 (66.50±2.47)%，5組間差異有統計學意義 (F=362.92，P＜0.01);其中空白組與陰性對照組STAT3 mRNA表達抑制率間差異無統計學意義 (P=0.094);RNAi－1組、RNAi－2組和RNAi－3組STAT3 mRNA表達抑制率與空白組、陰性對照組比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05);且3組STAT3 mRNA表達抑制率依次降低，組間兩兩比較差異有統計學意義 (P＜0.05)。

圖1 RT－PCR檢測轉染后各組STAT3 mRNA的表達Figure1 Expression of STAT3 mRNA in each group detected by RT－PCR

2.3 轉染后STAT3的表達 Western blotting檢測結果見圖2，發現STAT3表達水平受到不同程度的抑制，其中空白組、陰性對照組、RNAi－1組、RNAi－2組和RNAi－3組STAT3表達抑制率分別為 (44.35±2.04)%、 (43.10±2.59)%、(83.57±1.56)%、(77.05±0.54)%和 (69.44±2.76)%，5組間差異有統計學意義 (F=248.08，P＜0.01);其中空白組、陰性對照組STAT3表達抑制率間差異無統計學意義 (P=0.472);RNAi－1組、RNAi－2組、RNAi－3組 STAT3表達抑制率與空白組、陰性對照組比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05);且3組STAT3表達抑制率依次降低，組間兩兩比較差異有統計學意義 (P＜0.05)。STAT3的表達與其mRNA的表達情況相符，證明RNAi－1組的干擾效果高于另外兩組。故后續實驗中所使用的均為RNAi－1組質粒轉染過的FLS。

圖2 Western blotting檢測各組轉染后STAT3的表達率Figure2 Expression of STAT3 detected by Western blotting

2.4 靶向抑制STAT3對FLS增殖的影響 經過不同時間點的檢測，空白組、陰性對照組以及RNAi組在490 nm處的A值分別為 (0.553 3±0.343 2)、(0.535 0±0.337 3)和 (0.158 3±0.079 4)，3組間差異有統計學意義 (F=3.761，P=0.047)。其中空白組A值與陰性對照組比較，差異無統計學意義 (P=0.912);RNAi組A值與空白組、陰性對照組比較，差異均有統計學意義 (P值分別為0.028和0.035，見圖3)。

3 討論

盡管RA的病因以及發病機制尚未完全明確，但是有研究證實細胞因子在RA的發生過程中起到了核心的致病作用。RA患者的滑膜炎癥中有重要生物學作用的細胞因子，如γ干擾素 (IFN－γ)、白介素 (IL) －2、IL－4、IL－6、IL－7、IL－10、IL－12、IL－15等均通過JAK－STAT信號轉導通路發揮作用［1－2］，最終導致FLS增殖與凋亡的失衡。而JAKSTAT通路是一個重要的細胞因子信號轉導通路，在調節細胞增殖、分化、凋亡以及免疫調節、炎癥、腫瘤等多種病理生理過程中發揮重要的作用。因此，其調控的基因也包括多個方面:凋亡相關基因如Fas、Bcl－2、Bax;炎癥相關基因如環氧合酶2(COX －2)、IL－6、IL －8、內皮素 －1［3］、還原型輔酶Ⅱ (NADPH)氧化酶［4］等。然而，許多在RA中表達顯著升高的細胞因子，如IL－6、IL－15、粒－巨噬細胞集落刺激因子 (GM－CSF)等都是通過激活JAK－STAT通路中的STAT3來發揮其生物學效應的。而STAT3在FLS的增殖、破骨細胞和Th17細胞的誘導以及RANKL途徑的表達中都是必須的［5－7］。在小鼠的膠原誘導關節炎 (CIA)模型中已經證實，IL－6、IL－1、腫瘤壞死因子α(TNF－α)等促炎細胞因子直接或者間接地激活STAT3，最終導致關節的持續性炎癥和破壞［8］。由此可見，STAT3在RA的慢性炎癥和關節的破壞中都是重要的調節因子。因此，如果能選擇性地阻斷STAT3的表達，可能會對RA具有潛在的治療作用。

圖3 各組FLS的增殖曲線Figure3 Proliferation curves of FLS in different groups

RNA干擾 (RNA interference，RNAi)技術是近年來備受關注的一個分子生物學技術，是將與某一mRNA序列相對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA導入到細胞中，使與其同源互補的mRNA降解，抑制細胞特定基因的表達，又稱為基因沉默。RNAi具有高效性、特異性、ATP依賴性、位置效應等特點［9］。因此，本實驗通過RNAi技術選擇性地沉默STAT3，使STAT3的表達受到了抑制，同時也就是阻斷了這些炎性遞質表達的共同通路。結果顯示，RNAi－1組、RNAi－2組、RNAi－3組STAT3 mRNA表達受到了一定的抑制，并且其蛋白質水平的表達也受到了抑制，二者的抑制結果及程度一致。轉染后的FLS生長受到了抑制，同時間檢測其活細胞的數量明顯少于空白組及陰性對照組，生長速度亦較這兩組緩慢。由此，可以進一步明確RA的發病機制，同時為RA的基因治療提供理論基礎和實驗依據。

由于目前尚無完全滿意的治療RA的方法，而基因治療是目前治療RA最具有前景的方法，并且基因治療的方法在治療關節炎和相關的關節紊亂中已經有所發展，許多動物實驗已經證明其具有很高的療效性，并且一些臨床試驗也證明了該法是安全的［10－12］。細胞因子通過其過度表達導致RA的持續性炎癥和關節破壞，從而引起了患者身體功能受損以及關節的疼痛，都會使患者的日常生活活動受到限制，生活質量降低。因此，推測通過基因治療的方法特異性地阻斷JAK－STAT通路將能夠達到改善RA病理過程的目的，從而改善RA患者的生活質量。未來可以研究針對該通路的特異性拮抗劑或者抑制劑，從而為RA的診斷以及治療提供新的靶點和研究方向。

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