C反應蛋白和生長停滯特異性基因產物6基因交互作用與中國漢族人群缺血性腦卒中及其亞型的關聯研究

李曉峰，陳忠云，李 婧，高永俊，趙曉麗，趙 靜，楊 旭

卒中是人類致死和致殘的世界第二大疾病[1]，其中，75%是缺血性腦卒中(IS)。但傳統的危險因素，如高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙等不能解釋所有的卒中事件。研究表明，遺傳因素在IS易患性中起著重要作用[2-3]；炎癥反應與IS的發生風險、進展及結局亦密切相關[4]。因此，編碼炎性分子的基因變異可能影響IS的發生、發展過程，且已有許多關于不同的炎性候選基因與IS的發病機制的研究[5-6]。如C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、生長停滯特異性基因產物6(growth arrest-specific gene 6,GAS6)等[7-9]。但隨著研究的深入，學者們發現單個位點的主效應可能僅引起較弱的效應，因此，越來越多的學者們致力于研究不同基因之間的交互作用。在此背景下，本研究采用回顧性病例對照研究，評價促血栓和促動脈粥樣硬化的CRP和GAS6基因多態性的獨立效應，并進一步采用基于多因素降維法(multifactor dimensionality reduction,MDR)的廣義的多因素降維法(generalized multifactor dimensionality reduction,GMDR)對二者之間潛在的基因-基因交互作用進行研究。鑒于不同的卒中亞型有不同的遺傳因素，本研究亦對IS亞型進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用回顧性病例對照研究。于2010年10月—2012年12月連續收集入住航天中心醫院神經內科的IS患者129例為病例組，其中男86例，女43例；平均年齡(67.0±9.8)歲；均為發病5 d內入選。所有患者于入院48 h內經顱腦CT或MRI證實，并以頸部血管超聲、顱腦彩色多普勒(必要時行顱腦CT血管造影或磁共振血管造影等檢查)評價腦血管狀態，IS診斷符合WHO卒中診斷標準[10]。同時根據TOAST分型[11]，分為大動脈粥樣硬化性腦卒中(large-artery atherosclerosis，LAA )91例和小動脈閉塞性腦卒中或腔隙性腦卒中(small-artery occlusion，SAA)38例，同時剔除心源性栓塞、其他原因類型(SOD)及不明原因(SUD)的IS患者。同期從體檢中心隨機選取非IS者192例為對照組，其中男90例，女102例；平均年齡(67.2±6.2)歲；根據臨床分析和實驗室評估，除患有高血壓、糖尿病和冠心病外，無其他任何身體不適。

1.2 資料收集 測量血壓、血糖、血脂、身高、體質量，計算體質指數(BMI)；詢問冠心病病史、腦卒中家族史、吸煙史、飲酒史等。高血壓定義為收縮壓≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90 mm Hg或當前應用降壓藥物；糖尿病定義為目前服用降糖藥物，或空腹血糖≥7.0 mmol/L。冠心病定義為既往有明確的心絞痛、心肌梗死病史。腦卒中家族史定義為至少有1個一級直系親屬曾患腦梗死。吸煙史定義為5年吸煙>10支/d。飲酒史定義為至少每星期飲酒1次，且每次>50 ml，連續半年以上。以BMI≥25 kg/m2為肥胖和(或)超重。如果與患者無法溝通，可通過其直系親屬采集病史資料。本研究協議經當地倫理協會和醫院倫理委員會審查批準，所有患者簽署知情同意書。

1.3 單核苷酸多態性(SNP)選擇及基因型確定 既往研究發現的GAS6 SNP位點中，僅有第8內含子rs8191974:G>A基因型頻率有差異，因此本研究選擇此位點。同時依據HapMap數據庫(http://www.hapmap.org)，并運用Haploview 3.0軟件(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)，在HapMap Format中讀取CHB數據，設置最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)的最小值為0.01，以SNP之間r2>0.8的原則，選擇CRP rs1130864:C>T和rs3093059:T>C、GAS6 rs8191974:G>A和rs7400722:C>T共4個SNP位點。

研究對象于次日清晨采集空腹靜脈血2 ml(EDTA抗凝)，用鹽析法提取外周白細胞中基因組DNA。采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術檢測各SNP基因型，所用引物均應用軟件Premier 5.0自行設計，上海英俊生物技術有限公司合成。PCR反應結束后，擴增產物經3%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像分析系統觀察PCR擴增結果。PCR產物由2 U限制性內切酶(NEB公司) 進行消化，65 ℃溫育1 h，反應終產物經含溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物。分型后取5%樣本量行直接測序驗證(見表 1)。

表1 CRP和GAS6 SNP引物序列、限制性內切酶和酶切產物長度

注：F為正向引物，R為反向引物

2 結果

2.1 對照組與病例組一般資料比較 對照組與病例組年齡、BMI比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；與對照組比較，病例組男性比例、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)水平及高血壓病史、糖尿病病史、冠心病病史、腦卒中家族史、吸煙史、飲酒史比例升高，總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。對照組與LAA組、SAA組年齡、BMI比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；與對照組比較，LAA組和SAA組男性比例、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、TG、LDL水平及高血壓病史、糖尿病病史、冠心病病史、吸煙史比例升高，TC、HDL水平降低，LAA組腦卒中家族史、飲酒史比例升高，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 對照組與病例組一般資料比較

注：LAA=大動脈粥樣硬化性腦卒中，SAA=小動脈閉塞性腦卒中或腔隙性腦卒中，BMI=體質指數，TC=總膽固醇、TG=三酰甘油，HDL=高密度脂蛋白，LDL=低密度脂蛋白；與對照組比較，*P<0.05；△為χ2值；☆為對照組與病例組比較；★為對照組、LAA組、SAA組比較

2.2 基因型分析 CRP rs3093059:T>C和 rs1130864:C>T、GAS6 rs8191974:G>A和rs7400722:C>T 4個SNP位點均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗，基因頻率能夠代表群體的基因分布。對照組與病例組，對照組與LAA、SAA組基因型分布比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表 3)。

表3 不同組間基因型分布比較(例)

注：☆為對照組與病例組比較；★為對照組、LAA組、SAA組比較

2.3 基因-基因交互作用與IS易患性分析 LAA組基因交互作用差異有統計學意義(P<0.05)，CRP rs3093059和GAS6 rs7400722為最佳交互作用模型(檢驗樣本一致性=61.29%；交叉驗證一致性=10；P=0.0107，見表4～6)。

表4 對照組與病例組GMDR分析結果

注：X1= rs1130864，X2= rs3093059，X3= rs8191974，X4=rs7400722

進一步采用樹狀圖分析二者之間的交互作用。CRP rs3093059與GAS6 rs7400722在相同分支，且相互靠近。而CRP rs1130864與GAS6 rs8191974在不同分支，且距離較遠(見圖1)。

交互放射圖顯示CRP rs3093059與GAS6 rs7400722具有明顯的交互效應。獨立分析顯示CRP rs3093059 占1.08%，GAS6 rs7400722占1.04%，兩個SNP間的交互作用在交互放射圖中占主導地位(1.49%，見圖2)。

表5 對照組與LAA組GMDR分析結果

注：X1= rs1130864，X2= rs3093059，X3= rs8191974，X4=rs7400722

表6 對照組與SAA組GMDR分析結果

注：X1= rs1130864，X2= rs3093059，X3= rs8191974，X4=rs7400722

圖1 LAA組的交互樹狀圖

圖2 LAA組的交互放射圖

2.4 Logistic回歸分析 rs3093059 TC+CC和rs7400722 CT+TT具有較高的LAA發生風險(P=0.041)，進一步采用多因素Logistic回歸分析，校正高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒、冠心病和腦卒中家族史相關危險因素后，結果亦未改變(P=0.039，見表7)。

表7 rs3093059與rs7400722聯合作用與LAA的相關性

3 討論

本研究依據既往研究結果及HapMap數據庫，選擇中國漢族人群CRP基因rs3093059:T>C和rs1130864:C>T、GAS6基因rs8191974:G>A和rs7400722:C>T 4個SNP位點探討炎性基因間交互作用與IS及其亞型相關性。單位點分析表明，4個SNP位點與IS及其亞型的發生均無相關性，與既往Kuhlenbaeumer等[8]、Hurtado等[9]的研究結果一致。

MDR是由Ritchie等[12]首次在研究散發性乳腺癌的研究中使用。MDR雖不能分析危險因素的主效應，但能發現高階的交互作用，尤其適合在發病機制復雜的疾病中探討基因-基因、基因-環境之間的交互作用，可以更好地解釋疾病基因水平的發病機制。本研究采用GMDR分析發現，LAA組rs3093059:T>C與rs7400722:C>T之間存在交互作用。多因素Logistic回歸分析表明，隱性模型rs3093059 TC+CC和rs7400722 CT+TT與rs3093059 TT和rs7400722 CC相比，具有較高的發病風險，校正相關危險因素后，結果一樣。表明CRP rs3093059 C與GAS6 rs7400722 T二者可能共同促進了LAA的發生。

CRP是一種急性炎癥時相反應蛋白，既往研究表明，其可誘導內皮細胞黏附分子的產生[10，13]，促使原型LDL形成泡沫細胞[11，14]，通過受體介導的趨化反應募集單核細胞[15]，并誘導其釋放組織因子[16]，進而促進動脈粥樣硬化的發生、發展，進而導致IS的發生。rs3093059:T>C位于CRP基因假定的啟動子區，其可能在一定程度上調控CRP的表達，影響血清CRP水平。目前關于該位點的相關性研究尚少，國內學者Shen等[17]采用病例對照研究，檢測了中國漢族548例IS患者和993例非IS對照人群rs3093059的SNP，結果顯示rs3093059加性模型〔OR=0.697，95%CI(0.528，0.921)，P=0.011〕、顯性模型〔OR=0.671，95%CI(0.487,0.923)，P=0.044〕及最小等位基因C〔OR=0.811，95%CI(0.666，0.988)，P=0.037〕與IS的發生密切相關，表明等位基因C可作為IS的一個保護因素。Ben Assaya等[18]探討rs3093059多態性與頸總動脈內膜中層厚度相關性，多因素分析表明，rs3093059等位基因C與冠狀動脈造影(CCA)內膜中層厚度(IMT)亦有關〔OR=1.74，95%CI(1.11，2.77)，P=0.002〕。

GAS6是維生素K依賴蛋白家族的一員，可與其受體酪氨酸激酶家族(包括Axl、Sky、 Mer)結合，參與炎癥反應[19-20]、血小板聚集[21-22]和動脈粥樣硬化[23-24]等IS發病機制的發生。rs7400722:C>T位于內含子區，推測該SNP位點可能引起剪切位點改變，繼而影響轉錄及轉錄后加工等過程，導致編碼GAS6的蛋白質功能異常或活性改變[25]，進而影響血小板活化和動脈粥樣硬化的進程，最終促進IS的發生。筆者先前的研究結果顯示rs7400722:C>T與IS及其亞型的發生均無相關性[26]。在本研究中，通過GMDR分析，發現該位點與rs3093059:T>C存在交互作用，推測CRP和GAS6二者可能共同參與了動脈粥樣硬化的發生、發展，共同導致了IS的發生。

此外，本研究亦存在一定的不足。首先，樣本量小，論證強度較低；其次，僅對4個常見的SNP位點進行分析，未對其他與IS相關的候選基因進行研究；最后，所選SNP并不能完全代表整個基因，下一步仍需結合人類HapMap數據庫選擇多個SNP標簽。

綜上所述， rs3093059:T>C與rs7400722:C>T之間存在交互作用，隱性模型rs3093059 TC+CC可能協同rs7400722 CT+TT增加了LAA的發生風險，CRP和GAS6基因可能共同影響了IS的易患性。

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