微囊藻毒素-LR對大鼠行為認知能力及血腦屏障通透性的影響

李洋，周玨，孫冰，李雪珂，李云暉

(東南大學公共衛生學院環境醫學工程教育部重點實驗室，江蘇南京 210009)

微囊藻毒素(MCs)可以導致多器官毒性[1]。迄今已從微囊藻和其它藍藻中分離鑒定了近80種MC同系物[2]，其中在環境中存在較為普遍的有MC-LR和MC-RR，尤以MC-LR含量最多、毒性最大[3]。越來越多的實驗表明，MC-LR還可能對神經系統功能產生損害作用[4]。而目前有關MC-LR神經毒性以及相關毒性作用機制的研究報道較少。

血腦屏障(blood brain barrier，BBB)保持著中樞神經系統內環境的穩定，而內皮細胞之間的緊密連接是保持內環境穩定的主要結構之一。將MCs靜脈注射入大鼠體內后，在腦內可以檢測到少量 MCs的蓄積[5]，由此提示 MCs可能會透過 BBB而進入腦內。本研究利用水迷宮實驗和曠場實驗，研究MC-LR對大鼠的認知和自發行為的影響，通過觀察大鼠染毒后的BBB通透性，為研究MC-LR對神經系統的損傷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SD大鼠40只，體重80～100 g，由上海斯萊克實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.2 主要試劑與儀器

MC-LR標準品、伊文思藍(EB，美國Sigma公司)，UV-2100型紫外2可見分光光度計(中美合資UNICO)，Ethovision XT行為學分析系統(荷蘭Noduls公司)。

1.3 動物飼養和分組

實驗動物飼養于東南大學公共衛生學院SPF級動物屏障系統，飼養環境為18～23℃，相對濕度45%～55%。適應環境1周之后按體重隨機分為4組，每組10只。灌胃染毒，染毒時間3個月。3個劑量組染毒劑量依次為 0.13、0.5、20 μg·kg－1MC-LR。對照組注射相同體積0.9%生理鹽水。染毒期間，大鼠自由攝食和飲水。

1.4 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮由1個圓形水池(直徑160 cm)、圖像采集系統、電腦操作分析系統組成，是研究動物空間學習記憶功能常用的經典模型工具[6]。水迷宮水池分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個象限。水溫保持在22～26℃，排除環境因素對實驗的干擾。Morris水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間探索實驗兩個部分。使用Noldus公司開發的動物行為軌跡跟蹤分析系統Ethovision TX 7.0軟件分析結果。

1.5 曠場實驗

將小鼠放入曠場的正中央格并開始計時，觀察大鼠在5 min內的行為，記錄大鼠在5 min內的總運動距離、在中央區域和周圍區域的次數、運動行為(包括站立、修飾等行為)的持續時間。

1.6 EB測定BBB通透性變化

各組大鼠處死前股靜脈注入2%EB 2 ml·kg－1，經心臟灌注生理鹽水后迅速斷頭取腦，分離左右半球，按1 ml·(100 mg)－1腦組織加入甲酰胺溶液，60℃水浴抽提 24 h，1 000 r·min－1離心 5 min，用 Spectronic 21型紫外可見分光光度計在620 nm處測光密度值，計算各組腦組織EB含量(μg·g－1)。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 MC-LR對大鼠學習能力的影響

表1實驗結果顯示，隨著訓練天數的增加，各組大鼠平均逃避潛伏期總體呈下降趨勢。但各染毒劑量MC-LR組在各個時間點觀察到的實驗結果與對照組相比差異均無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 MC-LR對大鼠記憶能力的影響

實驗結果見表2。對各組總游程和游速進行比較顯示，高劑量MC-LR組在相同時間內的總游程和游速比對照組明顯增加(P＜0.05)。各染毒劑量MC-LR組穿越平臺次數雖然比對照組有所下降，但差異無統計學意義;并且各劑量MC-LR組大鼠在平臺象限停留時間和對照組相比并無變化。

2.3 MC-LR暴露3個月后大鼠曠場實驗結果

表3結果顯示，與對照組相比，高劑量MC-LR組大鼠5 min內在敞箱里的總運動路程和運動行為的持續時間明顯增加，差異具有統計學意義(P＜0.05)。高劑量MC-LR組大鼠進入中央區域的時間明顯減少，在邊緣區域的行為增多，與對照組相比差異具有統計 學意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠不同時段平均逃避潛伏期比較(±s，n=10)秒Tab 1 The comparison of escape latency of different groups(±s，n=10) s

表1 各組大鼠不同時段平均逃避潛伏期比較(±s，n=10)秒Tab 1 The comparison of escape latency of different groups(±s，n=10) s

組 別不同時段平均逃避潛伏期第1天 第2天 第3天 第4天±6.91 0.13 μg·kg－1MC-LR 組 97.25±13.08 73.61±16.53 50.02±13.34 40.99±11.53 0.5 μg·kg－1MC-LR 組 98.23±15.40 62.45±15.67 41.55±14.01 34.83±10.21 2.0 μg·kg－1MC-LR 組 93.12 ±19.52 73.13 ±8.09 56.21 ±15.42 30.60 ±7.33對照組 100.41±15.32 64.85±16.23 47.75±11.95 21.74

表2 各組大鼠空間探索實驗指標比較(±s，n=10)Tab 2 The comparison of spatial probe test of different groups(±s，n=10)

表2 各組大鼠空間探索實驗指標比較(±s，n=10)Tab 2 The comparison of spatial probe test of different groups(±s，n=10)

a與對照組比較，P＜0.05

組 別 總游程/cm 游速/cm·s－1 穿越平臺次數 平臺象限停留時間13.07 0.13 μg·kg－1MC-LR 組 2 469.97±276.28 20.58±2.30 16.6±6.87 46.40±11.91 0.5 μg·kg－1MC-LR 組 2 466.07±230.87 20.55±1.92 15.5±4.74 45.19±12.47 2.0 μg·kg－1MC-LR 組 2 577.79 ±177.07a 21.48 ±1.48a/s對照組 2 302.52±111.30 19.19±0.93 17.5±4.25 45.58±15.6±5.27 52.32±15.31

表3 各組大鼠曠場實驗指標比較(±s，n=10)Tab 3 The comparison of open field test of different groups(±s，n=10)

表3 各組大鼠曠場實驗指標比較(±s，n=10)Tab 3 The comparison of open field test of different groups(±s，n=10)

a與對照組比較，P＜0.05

組 別 運動總路程/cm 中央區域時間/s 邊緣區域時間/s 運動持續時間.58±13.07 0.13 μg·kg－1MC-LR 組 3 537.43±672.36 16.82±5.17 276.42±24.87 146.40±11.91 0.5 μg·kg－1MC-LR 組 3 505.47±758.74 18.54±8.45 269.26±15.63 145.19±12.47 2.0 μg·kg－1MC-LR 組 3 708.90±547.29a 12.50±6.17a 287.24±9.94a 152.32±15.31/s對照組 3 223.42±424.01 23.64±9.75 254.02±24.74 145 a

2.4 各組大鼠BBB通透性的變化

對照組和3個劑量MC-LR組大鼠通過BBB的EB含量依次為(2.12± 0.32)、(2.88±0.87)、(3.16±0.63)、(3.40 ±1.10)μg·g－1，顯示隨著染毒劑量的增加，腦組織EB含量逐步增加，高劑量MC-LR組的EB含量明顯高于對照組(P＜0.05)。

3 討 論

研究表明，大鼠經口腔灌注或者腹腔注射MC-LR后在其大腦中發現MC-LR的蓄積[7]。藍藻提取物定位注射入大鼠腦內，觀察到大鼠的空間學習能力有所降低[8];當暴露濃度≥10 μg·L－1時，MC-LR 可以導致秀麗線蟲頭部擺動頻率和身體彎曲頻率顯著降低[9]。這些研究初步證實了MCs有可能進入大腦造成神經系統的毒性損傷。

神經毒物導致學習記憶等方面的功能障礙，是一個慢性病理過程。定向航行實驗所形成的記憶屬于陳述性記憶，其儲存的機制涉及海馬和大腦皮層有關腦區[10]。而丘腦和海馬結構則在空間工作記憶中起重要作用。在水迷宮實驗中，未觀察到MC-LR各劑量組和對照組之間的明顯差別，說明MC-LR并未對大鼠的空間學習和記憶能力造成損傷。李曉波等同樣采用大鼠灌胃染毒方式，60 d后的水迷宮實驗也尚未證明MC-LR對大鼠空間記憶能力產生影響[11]。

曠場實驗是用于評價大鼠在新異環境下自發、探究行為與緊張度的一種方法。而對新環境的適應也可判斷大鼠認知能力[12]。實驗結果顯示:MC-LR 20 μg·kg－1劑量組大鼠進入中央區域的時間明顯減少，在邊緣區域的行為增多，說明大鼠的探索行為受到抑制;大鼠的總運動路程和運動行為的持續時間明顯增加。此結果與空間探索實驗的結果一致，表明MC-LR可以增加大鼠在進入暗箱以及搜尋平臺過程中的緊張度。

BBB由腦內毛細血管的內皮和內皮細胞之間的緊密連接、基膜以及神經膠質細胞突起構成，可以阻止一些具有神經毒性的物質進入腦內。有研究表明，MC-LR可由OATP1A2介導跨越BBB，轉運至大腦[5]，Feurstein等[13]的研究結果證明至少有5種mOatps參與原代全腦細胞在mRNA水平的表達。最近，Daniel等[14]進一步在小鼠神經元細胞體系中證實了有機陰離子轉運肽在MC-LR透過BBB進入腦組織過程中發揮重要作用，但尚無動物實驗的證據表明MC-LR可以造成BBB的損傷。EB是小分子指示劑，與血漿蛋白結合后不通過BBB，只有當BBB被破壞、通透性增加時才進入腦組織。本研究采用EB作為示蹤劑，結果發現，MC-LR 20 μg·kg－1劑量組腦組織中 EB 含量明顯高于對照組，說明MC-LR可以引起BBB通透性的增加，與Cazenave等[15]實驗結果的推論相符。

本研究顯示，MC-LR增加了大鼠的BBB通透性，并且改變了大鼠的探究行為能力和緊張度，相關的神經損傷機制有待進一步的研究。

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