Hsa_circ_0001947對胃癌細胞增殖和凋亡的影響

陳正威，章安偉，張垚，張烜烽，袁海濤，步雪峰

(1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學附屬昆山醫(yī)院普外科，江蘇 昆山 215300；3.江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

環(huán)狀RNA是一種特殊非編碼RNA，廣泛存在于生物體內(nèi)[1-2]。其不僅與多種疾病密切相關(guān)，且具有潛在的癌癥診斷與生物治療價值[3]。研究顯示，目前已在胃癌患者的胃癌組織、細胞，甚至血漿中發(fā)現(xiàn)多種表達失調(diào)的環(huán)狀RNA[4-6]。Hsa_circ_0001947是一種內(nèi)源性環(huán)狀RNA，定位于X染色體: 147743428-147744289，廣泛表達于人體各組織器官，但其目前在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不清楚。本研究擬觀察hsa_circ_0001947在胃癌細胞、組織中的表達，并分析其對胃癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2017年7月至2018年8就診于江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科的75例胃癌患者，行全胃或胃大部切除術(shù)后，收集胃腺癌及癌旁組織(距離癌組織>5.0 cm)標本，手術(shù)標本切除后30 min內(nèi)迅速放入液氮中冷凍，然后于-80 ℃長期保存。標本采集均得到患者同意，并經(jīng)江蘇大學附屬人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 細胞株和主要試劑

高通量測序(上海歐易生物醫(yī)學技術(shù)有限公司)；人胃癌MGC-803、BGC-823、SGC-7901、HGC-27細胞(中國科學院上海生科院細胞資源中心)；正常胃黏膜上皮GES-1細胞株(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；胎牛血清、RPMI 1640、DMEM(以色列BI公司)；Trizol試劑(美國Ambion公司)；小干擾RNA(si-RNA，廣州銳博生物技術(shù)有限公司)；PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Ambion公司)；SYBR Green PCR預混試劑、熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、CCK-8試劑盒(南京厚載生物科技有限公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；羊抗兔Cleaved-caspase-3抗體(美國CST公司)；羊抗兔Bax抗體、羊抗鼠Bcl-2抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與細胞轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的RPMI 1640、DMEM于37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)胃癌BGC-823、SGC-7901、HGC-27以及MGC-803細胞。每24 h更換1次培養(yǎng)基，當細胞在培養(yǎng)瓶中覆蓋率達80%時進行傳代培養(yǎng)。細胞接種于6孔板中，當細胞達到50%～70%融合點時，將其分為si-circ_0001947組和si-NC組，分別加入si-circ_0001947,si-NC以及脂質(zhì)體2000，培養(yǎng)12 h，以備后續(xù)實驗用。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測胃組織、細胞中circ_0001947的表達水平 采用Trizol法提取75例胃腺癌、癌旁組織，4種胃癌細胞及胃上皮細胞中總RNA，并按TaqMan RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將4 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在CFX96實時定量PCR儀中，以GAPDH為內(nèi)參，量化circ_0001947的表達水平,使用SYBR Green PCR預混試劑行qRT-PCR，以2-ΔΔCt法反映circ_0001947相對表達水平。circ_0001947上游引物：5′-GTGAAACAAACAAAGGTGATGC-3′，下游引物：5′-ATTCCCACTAGGTGATTCTGA-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CCCACTTCTCTCTAAGGAGAAT-3′,下游引物：5′-TACACGAAAGCAATGCTATCAC-3′。

1.2.3 CCK-8實驗檢測細胞活力 取si-circ_0001947組和si-NC組2組BGC-823、SGC-7901細胞，分別接種于96孔板中，5 000個/孔，每組設置3個復孔，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞分裂周期分別于0、12、24、48、72 h進行CCK-8檢測[7]，每孔加入10 mL CCK-8試劑，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm處光密度值[D(450 nm)]。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細胞增殖 將si-circ_0001947組和si-NC組2組BGC-823、SGC-7901細胞分別接種于6孔板中(500個/孔)，每組設置3個復孔，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 d；每2～3 d換液一次，克隆細胞長至合適大小時終止培養(yǎng)；PBS清洗3次；加入甲醇于4℃固定細胞15 min；PBS清洗3次；每孔加入結(jié)晶紫1 mL染色20 min；加入雙蒸水清洗至洗凈背景；計數(shù)細胞克隆數(shù)，克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細胞總數(shù))×100%。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將BGC-823，SGC-7901細胞分別加入si-circ_000194與si-NC培養(yǎng)12 h；收集并消化細胞，用預冷PBS清洗3次；按照細胞凋亡試劑盒說明書操作，先用1×結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)其密度為1×106/mL；取100 mL懸液，加入5 mL Annexin V-FITC于室溫避光孵育5 min；加入10 mL一碘化丙錠，再加入400 mL PBS，上機進行檢測。

1.2.6 蛋白印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達

將胃癌BGC-823、SGC-7901細胞分別接種于6孔板中，分別加入si-circ_0001947，si-NC孵育12 h后提蛋白。依次行SDS-PAGE，350 mA 90 min濕轉(zhuǎn)至PVDF膜；BSA封閉1h；分別加羊抗兔Cleaved-caspase-3抗體(1 ∶300)，羊抗鼠Bcl-2抗體(1 ∶400)，羊抗兔Bax抗體(1 ∶400)，羊抗鼠β-微管蛋白(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次；加羊抗鼠或羊抗兔HRP-IgG(1 ∶3 000)室溫孵育2 h；TBST洗膜3次；增強型化學發(fā)光試劑顯影。Image J對蛋白條帶吸光度進行定量分析。

1.2.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌組織中差異環(huán)狀RNA的表達譜

通過高通量測序篩選出5例臨床胃腺癌、癌旁組織中差異表達的5種環(huán)狀RNA，分別為hsa_circ_0000033，hsa_circ_0000038，hsa_circ_0004916，hsa_circ_0058092，hsa_circ_0001947。與癌旁組織相比，胃腺癌組織中hsa_circ_0000033，hsa_circ_0000038及hsa_circ_0004916表達明顯下調(diào)(t=3.332，2.791，8.901，P均<0.05)，hsa_circ_0058092和hsa_circ_0001947表達明顯上調(diào)(t=10.631，15.360，P均<0.01)，見圖1。挑選上調(diào)最明顯的hsa_circ_0001947進行后續(xù)實驗。

a : P<0.05，b: P<0.01，與癌旁組織相比

2.2 circ_0001947在胃癌組織及胃癌細胞中的表達

由圖2可見，胃癌組織中circ_0001947相對表達量顯著高于癌旁組織(t=8.019，P<0.01)。4株胃癌細胞中circ_0001947相對表達量均明顯高于人胃上皮GES-1細胞(P<0.05或P<0.01)。circ_0001947在胃癌細胞BGC-823中相對表達量最高，在SGC-7901中最低，故挑選這兩種細胞株繼續(xù)進行后續(xù)實驗。

a : P<0.05，b : P<0.01, 與GSE-1細胞相比

2.3 si-RNA顯著下調(diào)胃癌BGC-823，SGC-7901細胞中circ_0001947表達量

胃癌BGC-823,SGC-7901細胞轉(zhuǎn)染si-RNA 12 h后，si-circ_0001947組中circ_0001947相對表達量明顯低于si-NC組(t分別為10.011，4.933，P均<0.01)，由此表明si-RNA對胃癌細胞中circ_0001947存在敲減作用。見圖3。

圖3 si-RNA干預后胃癌細胞內(nèi)circ_0001947表達水平

2.4 下調(diào)circ_0001947表達明顯抑制胃癌細胞增殖

CCK-8結(jié)果顯示，si-circ_0001947組BGC-823，SGC-7901細胞各個時間點D(450 nm)值均明顯低于si-NC組(P均<0.05)；circ_0001947組克隆形成率較si-NC組明顯降低(t=9.409，11.381，P均<0.01)。見圖4。

a: P<0.05, b：P<0.01, 與si-NC組比較

2.5 下調(diào)circ_0001947表達促進BGC-823、SGC-7901細胞凋亡

流式細胞儀檢測結(jié)果表明，si-circ_0001947組BGC-823，SGC-7901細胞凋亡明顯高于si-NC組率(t=5.620，3.711，P均<0.01)。見圖5。與si-NC組相比，si-circ_0001947組BGC-823，SGC-7901細胞中Cleaved-caspase-3(t=7.991，12.309，P均<0.01)與Bax(t=8.619，3.574，P<0.01或<0.05)相對表達量明顯升高；Bcl-2相對表達量明顯降低(t=14.527，2.588，P<0.01或<0.05)。見圖6。

圖5 流式細胞術(shù)分析各組細胞凋亡情況

a: P<0.05，b: P<0.01，與si-NC組比較

3 討論

以往研究顯示，環(huán)狀RNA在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，通過促進腫瘤細胞增殖，抑制其凋亡影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[8-10]。本實驗通過高通量測序挑選出一種新型環(huán)狀RNA hsa_circ_0001947進行研究，實驗結(jié)果顯示，circ_0001947在胃腺癌組織和胃癌細胞中表達水平明顯升高，說明circ_0001947在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮原癌基因功能。

張帥等[11]研究表明，環(huán)狀RNA hsa_ circ_0007766通過上調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1/CyclinE1/CDK4表達，從而促進肺腺癌細胞增殖，沉默hsa_circ_0007766表達后，細胞周期阻滯于G0/G1期，明顯抑制肺腺癌細胞生長。楊睿等[12]也證實，hsa_circ_0058514通過影響細胞周期蛋白CCNE1和CKD2表達，從而影響乳腺癌細胞周期。本研究通過CCK-8和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，circ_0001947 促進胃癌細胞增殖，下調(diào)circ_0001947表達后，胃癌細胞增殖明顯受抑制，推測可能與circ_0001947影響胃癌細胞分裂周期有關(guān)。此外，本實驗發(fā)現(xiàn)，與正常胃上皮細胞相比，胃癌細胞早期凋亡率與晚期凋亡率均明顯上升。Bcl-2和Bax屬于Bcl家族，是調(diào)控細胞凋亡的重要蛋白，其異常表達會導致細胞凋亡過程失常，增加腫瘤發(fā)生的風險[13-16]。凋亡是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[17]。本實驗結(jié)果顯示，敲減circ_0001947后，Cleaved-caspase-3、Bax的表達明顯上調(diào)，而Bcl-2表達顯著下調(diào)，由此推測circ_0001947在胃癌細胞中可能通過影響凋亡相關(guān)蛋白表達，從而抑制胃癌細胞凋亡。但circ_0001947調(diào)控胃癌細胞周期蛋白與凋亡相關(guān)蛋白表達的具體機制尚有待進一步研究。

綜上所述，hsa_circ_0001947在胃腺癌組織和細胞中呈高表達，其可能通過影響細胞周期促進胃癌細胞增殖，影響凋亡相關(guān)蛋白表達抑制胃癌細胞凋亡。