轉化生長因子β1基因-509C/T多態性與原發性腎病綜合征相關關系的研究

項 新，黃典勝，施燕春，梁延秀，黃振華，何 坤，陸玲娜

原發性腎病綜合征(PNS)是常見的腎臟疾病，但目前其病因尚不明確。近年來，隨著分子生物學等研究手段的成熟和深入，一些研究結果顯示某些基因多態性與PNS的易患性、激素療效、疾病復發、病理進展及預后明顯相關，轉化生長因子β1(TGFβ1)作為最重要的導致腎小球硬化和腎間質纖維化的細胞因子之一，近年來受到國內外學者的關注。TGFβ1是一種具有多種生物學功能的細胞因子,在調節細胞外基質(ECM)代謝、參與炎癥反應和間質纖維化等方面起重要作用[1],TGFβ1基因定位于19q13.1-3,TGFβ1基因-509C/T單核苷酸多態性位點位于基因上游轉錄起始點前509 bp處-731～-453間,而此區域恰是TGFβ1基因的負性調控區[2]。本研究采用病例-對照研究、臨床病理分析和病例追蹤隨訪的方法,探討這一基因多態性位點與PNS發生、發展的相關關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 (1)PNS組：來自2005年1月—2012年1月廣西民族醫院腎內科住院患者，均取得患者及家屬的知情同意。PNS組80例患者均按照1992年黃山會議建議的腎小球疾病臨床分型標準診斷為PNS，排除了繼發性腎小球疾病。患者均行腎穿刺活檢，并且入院前2周內未應用激素類藥物。80例患者中男50例，女30 例，年齡16～70歲，平均(46.5±14.9)歲。(2)對照組：選取同期在本院進行健康體檢，且血、尿常規和肝腎功能正常,無原發、繼發性腎小球疾病及腫瘤等其他疾病者60例作為對照組。60例對照者中男40例，女20例，年齡20～71歲，平均(42.2±11.2)歲；兩組受檢者的性別構成、年齡間具有均衡性。

1.2 治療方法及療效判定 80例患者入院明確診斷后即給予潑尼松口服，1 mg·kg-1·d-1，療程8～12周。療效評定標準,有效:臨床癥狀消失,24 h 尿蛋白定量較前下降 50%以上,血清清蛋白升高,腎功能穩定； 無效:臨床癥狀無改善,仍為腎病綜合征或24 h 尿蛋白定量下降未達到治療前的一半,腎功能無變化或惡化。

1.3 基因組DNA的提取 抽取外周抗凝血5 ml,應用美國G￡T公司DAN提取試劑盒，嚴格按照說明書提取。

1.4 TGFβ1基因-509C/T基因型鑒定 參照文獻[2]設計引物,由華大基因上海鼎安生物科技有限公司合成。上游引物序列5′-GCT AAG GCA TGG CAC CGC TT-3′,下游引物序列5′-GAA GGA GGG TCT GTC AAC ATG GG-3′,聚合酶鏈反應(PCR)擴增含有(-509C/T)單核苷酸多態性位點的TGFβ1基因外顯子翻譯起始點的上游調控區域。 PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；再按下列程序循環35次，即94 ℃變性35 s，57 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s；末次循環后，72 ℃延伸10 min。PCR反應體積為30 μl，Eco811限制性內切酶37 ℃水浴消化，PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分帶，確定基因型。

1.5 收集患者病理資料和臨床資料 血壓、血肌酐、血尿素氮、血清清蛋白、三酰甘油、總膽固醇、24 h尿蛋白。血壓以患者首次入院后治療前在3個不同時間點安靜狀態下測量的血壓值的平均值為準。

1.6 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理。Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗群體代表性。計量資料組間比較采用方差分析，計數資料組間構成比的比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 TGFβ1基因-509C/T基因型分析

2.1.1 PCR擴增產物鑒定 擴增產物為包含TGFβ1基因-509C/T多態性位點在內的DNA片段，片段長度為270 bp，經1.5%瓊脂糖電泳鑒定，選擇擴增產物含量較高、特異性好者進一步進行RFLP分析(見圖1)。

2.1.2 -509C/T多態性酶切電泳和測序 酶切后CT基因型顯示3條條帶，片段長度分別為270 bp、198 bp和72 bp(72 bp很難觀察到)，TT基因型顯示2條條帶，片段長度分別為198 bp和72 bp，CC基因型顯示1條清晰條帶，片段長度為270 bp(見圖2)。

2.2 病例-對照研究 PNS組與對照組受檢者的TGFβ1-509C/T基因型及等位基因的分布頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 PNS組與對照組TGFβ1-509C/T基因型和等位基因分布頻率的比較〔n(%)〕
Table1 Comparison of the genotype and allele frequency of TGFβ1-509C/T polymorphism of patients with primary nephrotic syndrome and control subjects

組別例數基因型CC CT TT等位基因CTPNS組8020(25 0)25(21 3)35(43 7)65(40 6)95(59 4)對照組6015(25 0)20(33 3)25(41 7)50(41 7)70(58 3)χ2值0 0810 031P值>0 05>0 05

注：Lanes 1為DNA Marker DL 2000;Lanes 2、3、4、5、6為TGFβ1(-509C/T)
圖1 PCR擴增產物
Figure1 Amplification products of TGFβ1-509C/T gene

2.3 臨床分析 80例PNS患者中CC基因型者20例，CT基因型者25例，TT基因型者35例。TT基因型患者血肌酐、24 h尿蛋白水平高于CT基因型和CC基因型患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，而3種基因型患者的性別構成、年齡及血壓、血脂、血清清蛋白水平間差異均無統計學意義(P>0.05,見表2)。

2.4 病理分析 不同病理類型的PNS患者CC、CT、TT基因型分布頻率間差異有統計學意義(χ2=3.902，P<0.05),其中微小病變性腎小球腎炎、膜增生性腎小球腎炎、膜性腎病及局灶硬化性腎小球腎炎患者基因型分布頻率間差異無統計學意義(χ2=2.495，P>0.05,見表3)。

2.5 追蹤隨訪 治療有效組患者與無效組患者基因型及等位基因的分布頻率間差異均有統計學意義(P<0.05，見表4)。

注：Lanes 1、3、5、6、8：CT基因型，包括 270 bp 、198 bp、72 bp 片段；Lanes 4、7：CC基因型，包括270 bp片段；Lanes 2：TT 基因型，包括 198 bp、72 bp片段； M：DNA marker DL 2000
圖2 TGFβ1基因-509C/T多態性酶切
Figure2 Genotypes of TGFβ1-509C/T polymorphism by PCR-RFLP

表3 TGFβ1-509C/T基因多態性與PNS病理的相關性
Table3 Correlation of TGFβ1-509C/T polymorphism with primary nephrotic syndrome pathology

腎臟病理類型例數基因型(例)CCCTTT微小病變性腎小球腎炎10442系膜增生性腎小球腎炎254615膜增生性腎小球腎炎15555膜性腎病11344局灶硬化性腎小球腎炎19469

表2 TGFβ1-509C/T基因多態性與PNS臨床的相關性Table 2 Correlation of TGFβ1-509C/T polymorphism with primary nephrotic syndrome clinic

注：▲為χ2值；與CT、CC基因型比較，△P<0.05

表4 TGFβ1-509C/T基因多態性與PNS療效的相關性〔n(%)〕
Table4 Correlation of genotype and allele frequency of TGF β1-509C/T polymorphism with clinical effect in primary nephrotic syndrome

組別例數基因型CC CT TT等位基因CT有效組2810(35 7)10(35 7) 8(28 6) 30(53 6)26(46 4)無效組5210(19 2)15(28 8)27(52 0)35(33 7)69(66 3)χ2值4 035 987P值<0 05<0 05

3 討論

TGFβ1作為一種具有雙向性、多功能的細胞因子，主要在腎小球、腎小管上皮細胞和腎間質成纖維細胞表達,人類腎小球細胞表面有TGFβ1受體，TGFβ1通過與細胞表面特定的受體結合而發揮作用[3-5]，是一種公認的強效促纖維化細胞因子,動物實驗和臨床實踐均證實TGFβ1可通過Smad信號轉導途徑在腎小球硬化的發生、發展中發揮關鍵作用[6-7]。TGFβ1基因-509C/T單核苷酸多態性位點位于基因上游轉錄起始點前509 bp,處于-731～-453 bp間,而此區域恰是TGFβ1基因的負性調控區。有研究證實-509T等位基因與TGFβ1分子水平相關，且與雜合子相比，純合子循環中TGFβ1分子水平更高[4]。

腎病綜合征的病因尚未明確,有研究顯示血管緊張素轉換酶基因多態性[8]、載脂蛋白E基因多態性[9]、血小板活化因子分解酶基因多態性[10]、人類白細胞抗原基因多態性與PNS的易患性、 激素療效、 疾病復發、 病理進展及預后明顯相關，理論上TGFβ1基因-509C/T多態性位點與TGFβ1轉錄和循環TGFβ1水平有關,也應與腎病綜合征有密切關系。

本病例-對照研究結果顯示：PNS患者的TGFβ1基因-509C/T基因型及等位基因的分布頻率與健康對照者無明顯差異，故不認為此位點與PNS的遺傳易患性有相關關系，與Li等[11]的研究結果一致。

臨床分析結果顯示：TT基因型的PNS患者24 h尿蛋白及血肌酐水平較CT和CC基因型的患者明顯升高，以往研究發現，TGFβ1的轉錄活性和血漿水平與該基因啟動子區-509 C/T基因多態性有關，其中TT型的TGFβ1水平是CC型的近2倍[4]。因此推測TT基因型通過調控TGFβ1 mRNA轉錄活性，影響TGFβ1蛋白表達量，從而引起腎小球硬化和腎間質纖維化病變，加重蛋白尿，促進腎功能惡化，但CC、CT和TT基因型的PNS患者在年齡、性別構成及血壓、血清清蛋白、血脂水平方面無明顯差異，提示不同基因型的PNS患者在這些臨床表現方面差別不明顯。目前這方面研究報道甚少，有待積累更多的臨床資料做進一步探討。

腎小球系膜細胞和系膜基質彌漫增生為系膜增生性腎小球腎炎的病理特征，本研究中病理分析結果顯示系膜增生性腎小球腎炎患者TT基因型所占比例較高，CC基因型所占比例較低，提示CC基因型可能有保護性作用，而TT基因型可促進腎小球硬化，TT基因型與腎小球硬化顯著相關，可以推測，在腎組織局部分泌TGFβ1機制中,TT基因型可誘導細胞產生更多的TGFβ1,TGFβ1與腎小球固有細胞上相應受體結合，促進細胞增殖，增加ECM蛋白的合成和減少ECM的降解，并增強細胞表面ECM受體-整合素的表達,使細胞與基質黏附增強,促使ECM 沉積。以上作用的綜合結果導致腎小球發生系膜增生病理改變。本研究未發現其他4種病理類型患者的基因型分布頻率有差異，提示TGFβ1-509C/T基因多態性可能與這些病理改變關系不大。

跟蹤隨訪發現：治療有效和無效的患者基因型和等位基因的分布頻率明顯不同，TT基因型和T等位基因的PNS患者治療有效率低，易于表現為大量蛋白尿、持續性蛋白尿，因而TGFβ1-509C/T基因可作為判斷激素療效的一個遺傳學標志。

本研究結果提示：TGFβ1-509C/T基因多態性與PNS的發病易患性不相關，但可能與較重的蛋白尿、腎損害、腎小球硬化、激素療效相關。

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