微小RNA與臨床疾病

馮忠軍 孫寅 馮彥蕊 聞海豐 于文靜

2.濟寧醫學院附屬醫院檢驗科，山東，濟寧 272129

微小RNA（microRNA，miRNA）是繼小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）之后又一類最新發現的在真核生物體內廣泛存在的內源性單鏈小分子RNA。miRNA作為天然存在的重要的基因表達調控分子，自發現以來一直是國內外醫學研究的焦點。有報道證實存在于miRNA及其靶位點的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）和人類疾病的發生有密切關系[1]。特定miRNA表達譜可輔助臨床對疾病進行診斷、分型及預后，而以miRNA為靶點設計并開發新型分子藥物，可以為許多疾病尤其是腫瘤治療開辟新的途徑。

1 miRNA的研究方法

選擇正確的研究方法可為揭開miRNA參與人體生命過程的神秘面紗創造有利的條件。對于miRNA具體功能的研究，首先通過生物信息學預測候選miRNA基因，然后選擇合適的提取方法和檢測技術對其進行鑒定和驗證，基本上可以滿足大多數實驗的要求。

1.1 miRNA預測

當前知名miRNA數據庫有miRBase（http://www.mirbase.org） 及 miRNAMap（http://mimamaP.mbc.nctu.Edu.tw）等。它們提供了miRNA的具體位置，堿基序列和已知靶基因等生物學信息，基于這些數據，然后使用計算機軟件通過結構序列分析法、比較基因組法及機器學習類算法就可以在數據庫中初步篩選新的miRNA基因。結構序列分析法可辨別單物種中不同miRNA分子。比較基因組法主要用于對多物種序列高度相似的miRNA進行預測。機器學習類算法將miRNA初級序列和其二級序列進行結構組合從而進行篩選和預測新序列，在這三種方法中應用效果最好[1]。

1.2 miRNA提取

組織/細胞 miRNA提取方法主要有兩種：液相提取法和硅膠膜特異性吸附離心柱法。前者由于多次離心并使用乙醇洗滌沉淀總RNA，對小分子RNA損失較大，因此不適用于cDNA 文庫構建和Northern blot等對 RNA 完整性要求比較高的實驗。而后者則使用特殊硅基質膜特異性吸附包括小分子RNA在內的總RNA，對于長度為15～30 nt左右的siRNA和miRNA提取效果非常好，不過成本較高。循環miRNA的提取目前有很多試劑和商品化試劑盒可供選擇，如Invitroge公司的Trizol LS Reagent、Ambion的mirVana PARIS試劑盒以及北京天根miRcute miRNA提取分離試劑盒，獨特的裂解液配方對血液、血清/血漿、腦脊液等體液標本可實現快速抽提并分離RNA，一般單個樣品的操作30 min內即可完成。

1.3 miRNA檢測

當前miRNA檢測技術大致可分為兩類：一類基于核酸雜交原理，以RNA印跡、微陣列技術及原位雜交為代表；另一類則基于擴增原理，有實時熒光定量PCR、恒溫滾環復制、新一代測序技術等。其中微陣列技術、RNA印跡技術及實時熒光定量PCR技術最為常用。微陣列技術[2]是對miRNA進行大規模初篩的首選方法，它可以在非常短的時間內完成整個人體基因組的分析，高通量的檢測效率是其最大的特點和優勢。RNA印跡（Northern blot）可同時顯示miRNA的分子量和表達量的具體信息，是最經典最可靠最常用的miRNA檢測技術[3]，一般新方法的推廣和使用都需要此法加以鑒定和驗證,但是所需樣本量大、實驗過程步驟繁瑣、靈敏度低、多個探針易于目標miRNA分子發生交叉反應、檢測線性范圍窄。原位雜交技術的優點是能夠顯示miRNA表達的位置，尤其適用于病理組織樣本，但該技術提供的miRNA定量信息量很少，也缺少miRNA序列的信息。要想從低至pg的樣本中檢測到miRNA的存在還是依賴于靈敏度高特異性好的實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技術。采用qPCR技術檢測miRNA根據引物設計原理不同又可分為兩類，RNA加尾和引物延伸法和莖環逆轉錄引物法[4,5]。前者通過加尾反應從而延長反轉錄產物cDNA的長度，引物設計和反應體系都較為簡單，對同時檢測多個miRNA分子尤為適用。后者則使用5'端為特殊莖環結構的逆轉錄引物，與miRNA結合時不與莖環序列嚴格配對的miRNA 無法進行反轉錄,從而實現對目標miRNA分子的特異性篩選，使用這種引物在逆轉錄后增加了cDNA的長度，克服了miRNA長度短小而難于檢測的困難。此法也可用于胞內其他小分子如 siRNA 等的檢測，不過莖環法引物設計比較困難，成本高，檢測通量低。以上qPCR法信號檢測模式有熒光染料和TaqMan探針可供選擇。TaqMan探針雖然特異性和靈敏度都好，但針對不同的目的基因都需要單獨設計相對應的探針，成本非常高。SYBR Green I熒光染料目前最為常用，能與所有的雙鏈DNA結合，通用性好，但特異性稍差，由引物二聚體、單鏈二級結構及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響到定量的準確性。

2 miRNA及其靶位點的SNPs與疾病發生

SNPs即由單個核苷酸發生突變而引起的DNA序列變化。SNPs可發生在初級、前體以及成熟miRNA序列中，而miRNA與其靶基因mRNA的結合位點也存在一定數量的SNPs。這些SNPs均可通過影響microRNA對靶基因的調控過程從而在許多疾病的發生發展過程中扮演重要角色。

2.1 miRNA及其靶位點的SNPs與腫瘤

有研究發現，Pre-miR-146a序列中第+ 60位rs2910164中存在G-C轉換，此突變導致miR-146a表達水平顯著下降/升高隨后負反饋上調/抑制TRAF6、IRAK1以及PTC1等靶基因的表達進而參與了乳頭狀甲狀腺癌（多數見于GC基因亞型、患者miR-146a表達量下降）及家族性卵巢癌（多數見于CC基因亞型，患者miR-146a表達量升高）的發病機制[6]。有研究發現hsa-miR-196a中的rs11614913 SNP位點其C/C與C/T和T/T基因型相比，可作為肺癌早期診斷及預后評價的遺傳標記物[7]。Tchatchou等[8]證實位于雌激素受體1中的SNP（rs2747648），其等位位點T通過降低與miR-453的結合程度而引起雌激素受體1過度表達，這極有可能是乳腺癌發病的重要因素之一。Yang等[9]認為位于GEMIN3基因miRNA結合位點的 SNP （rs197414）不但參與了膀胱癌的發病過程，而且CC型和CA型個體罹患膀胱癌的機率更高。

2.2 miRNA及其靶位點的SNPs與其他疾病

存在于hsa- mir-196a2的rs11614913（C＞T）SNP位點與擴張性心肌病的發病有密切聯系[10]。Martin等[11]和Sethupathy等[12]幾乎同時報道，I型血管緊張素II受體（AT1R）第 1 166位點存在SNPs，其堿基A向 C的突變將會影響miR-155與靶基因AT1R mRNA的結合程度進而導致AT1R過度表達，由此增強了血管緊張素II的生物學功能，這極有可能是高血壓、心肌梗死等許多心血管疾病的發病機制之一。有報道IRAKI rs3027898多態性與類風濕性關節炎關系密切。成纖維生長因子20基因rs12720208位點C/T多態性可顯著增加帕金森的發病風險[13]。此外還有報道圖雷特氏（Tourette's）綜合癥以及注意力缺陷多動障礙（ADHD）及強迫障礙（OCD）患者第13號染色體上SLITRK 1基因的SNPs的發生可導致miR-189過度發揮其調控功能使得SLITRK 1表達量顯著降低，進而引起神經元樹突形成不良，由此增加了Tourette's綜合征等神經系統疾病的發病風險[14]。

3 miRNA與疾病診斷

雖然組織/細胞miRNA的異常表達對于疾病的診斷、預后及治療都有十分重要的臨床意義，不過對于組織/細胞miRNA，標本的獲取有一定的創傷性，并且來源有限無法進行連續檢測和隨訪，因而人們又將焦點轉向對體液miRNA的研究中。體液miRNA即細胞外游離狀態的miRNA，主要存在于人的血液及尿液等體液中。目前體液miRNA的來源尚未清楚，據推測其有可能隨著破碎的組織細胞被動漏出，或者先被包裹在微小體（microvesicle）及外泌體（exosome）中隨后再由患病組織細胞分泌后主動進入體液循環，在某些病理狀態下呈現特異性改變。

3.1 病理狀態下血清/血漿miRNA的變化

Lawrie等[15]首次證實在血清/血漿中可以檢測到一定數量的miRNA。隨后Chen等[16]報道，血清/血漿miRNA含量也十分穩定，可抵抗RNA酶的降解，也能夠耐受強酸、強堿、煮沸、反復凍融等各種極端條件，并進一步通過反復實驗發現let-7a、miR-192及miR-25等大多數miRNA分子在血清和血漿標本中的表達量及表達譜都具有高度一致性，不過血清miRNA與血細胞的相關系數更高。不同的腫瘤患者體內存在不同的血清/血漿miRNA分子，并且這些血清/血漿miRNA的表達量與正常健康人也有明顯差別，這些均提示血清/血漿miRNA作為新一代無創性分子標志物的可能性。

3.1.1 腫瘤血清/血漿miRNA的變化

腫瘤患者血清/血漿miRNA的特異性改變可為臨床提供多種疾病相關信息[16～24]：（1）腫瘤的早期或預后判斷：血清miR-25和miR-223可作為非小細胞肺癌的新一代生物學標志物，血清miR-496、miR-30d、miR-1及miR-499與非小細胞肺癌患者生存期密切相關。肝癌患者血清miR-500表達量明顯升高，術后降至正常，而血漿miR-92a的變化則與血清miR-500相反，提示miR-500和miR-92a對于肝癌的診斷和預后有重要的臨床意義，血漿miR-17-5p、miR-21、miR-106a及miR-106b對于胃癌有著極高的診斷價值，并有望用于胃癌預后判斷。血漿miR-210和miR-196a在胰腺癌中呈過度表達，已被證實可輔助臨床用于胰腺癌的診斷和預后。（2）用于腫瘤良惡性鑒別：血清miR-21、miR-141和miR-200等8種miRNA其含量的增加與卵巢癌惡性程度一致，而良性卵巢癌上述miRNA分子表達水平極低。（3）輔助判斷腫瘤的病理分型及分期：血漿miR-205在非小細胞肺癌的鱗癌中表達水平顯著升高，有助于非小細胞肺癌的鱗癌與腺癌分型。血漿miR-31的表達量在直腸癌IV期和II期有明顯不同。（4）區分疾病亞型：與乳腺癌組織孕酮受體陰性患者相比較，孕酮受體陽性患者血清miR-156呈過度表達，而乳腺癌雌激素受體陽性患者血清 miR-10b和miR-21的表達水平與雌激素受體陰性患者相比則明顯降低。

3.1.2 心血管疾病血清/血漿miRNA的變化

由于心臟組織標本通常很難取得，故而臨床診斷主要依賴于血清學標志物的應用。現已發現miR-133a、miR-499、miR-1和 miR-208a在正常健康人血漿中濃度極低甚至檢測不到，而在AMI時上述四種miRNA分子表達水平顯著上調，并且幾乎所有AMI患者出現典型臨床癥狀4 h后都可檢測到血漿miR-208a的存在，與肌鈣蛋白（cTnT）診斷靈敏度相當，miR-1還可作為反映疾病嚴重程度以及監測藥物治療效果的有效指標[25]。另有研究報道[26]miR-499僅來源于心臟組織，且在AMI患者血漿中表達水平顯著高于充血性心力衰竭患者和無心血管疾病患者，提示miR-499可特異性反映心肌損傷程度，是AMI患者較好的預測標志物。最近又有報道[27]使用由miR-142-5p、-498、-492、-1281、-151-5p、-802、-455-3p、-1250、-345等20個miRNA分子組成的獨特簽名（miRNA sinature）對AMI診斷準確性、敏感性、特異性分別高達93%、90%、96%。心力衰竭時血循環miRNA也會發生特性改變，有報道[28]血漿miR-423-5p的升高不僅可輔助臨床進行早期診斷，并且其表達水平與腦尿鈉肽（Brain natriuretic peptide，BNP）以及心功能分級呈顯著正相關，提示其有可能參與了心衰的發病過程。

3.1.3 糖尿病血清/血漿miRNA的變化

Chen等[16]發現血清 miRNA的特異性變化比血漿miRNA更能準確地反映2型糖尿病的患者病情。而最新又有報道[29]糖尿病患者血漿miR-15a、miR-29b、miR -126、miR-233和miR-28-3p的表達失調早于典型臨床癥狀表現，提示這些血漿miRNAs也可對糖尿病進行篩選和診斷，并能夠作為評價疾病轉歸的預測指標。

3.2 病理狀態下其他體液miRNA的變化

繼血清/血漿miRNA分子被發現以后，隨后人們在腦脊液、唾液、痰液、尿液、胸腔積液等人的其他體液中也檢測到了miRNA的存在，并且含量同樣穩定，而某些體液miRNA同血清/血漿miRNA一樣也可構成疾病的指紋，有良好的臨床應用前景。

3.2.1 阿爾茨海默病腦脊液miRNA變化

Cogswell等[30]報道有201 種 miRNA存在于阿爾茨海默氏癡呆患者腦脊液中，其中60種在5期和1期患者中的表達水平有明顯差異， 并且miR-146b和miR-142等在5期患者腦脊液中的表達量顯著下降，提示這些異常表達的miRNAs可輔助臨床確定阿爾茨海默病的病理分期。

3.2.2 口腔鱗狀細胞癌（OSCC）唾液miRNA變化

OSCC是頭頸部的惡性腫瘤之一，容易發生擴散和淋巴結轉移，大多數患者確診時已經失去最佳治療時機，所以早期發現并確診對OSCC來說尤為重要，唾液miRNA的發現則為OSCC診斷帶來了新的光明前景。Park等[31]通過大量實驗證明，無論是唾液還是經過處理的唾液上清液中都可檢測到一定數量的miRNAs,不過表達譜略有差異，提示這有可能與脫落的口腔上皮細胞不同有關。唾液miR-200a、miR-125a、miR-93及 miR-142-3p在 OSCC患 者 中表達水平呈顯著下調，進一步構建ROC曲線進行分析，結果顯示miR-200a和miR-125a 曲線下面積（area under the curve，AUC）分別為0.65和0.62，具有更高的診斷價值。另外，唾液miR-31和血漿miR-31一樣對于OSCC的早期篩選意義重大。

3.2.3 肺癌痰液miRNA變化

Xie等[32]最新報道肺癌中痰液miR-2l表達水平呈明顯上調，診斷價值比痰液細胞學檢查還要高。而且，痰液特定miRNA表達譜還有助于肺癌的病理分型，利用痰液 miR-205、miR-210、miR-708和 miR-21、miR-486、miR-375、miR-200b 可分別對鱗狀細胞肺癌和肺腺癌進行早期診斷。由此可見，檢測痰液miRNAs為肺癌早期篩選以及鑒別診斷提供了一種無創并且快速的新方法。

3.2.4 膀胱癌尿液miRNA變化

由于泌尿系統各組織或者器官分泌物都要通過尿液排出體外，因此對尿液中異常物質的檢測可實現對膀胱癌等泌尿系統疾病的普遍篩查和早期診斷。Hanke等[33]在他們的研究中發現，miR-126、miR-182和miR-199a在膀胱癌患者尿液中呈過度表達，miR-126和miR-182組合在一起ROC曲線顯示其AUC為0.768，診斷價值高，miR-126與miR-152的比值則有助于膀胱癌以及低分期原位膀胱癌的診斷，而miR-182與miR-152的比值對晚期膀胱癌診斷效果更佳，以上結果均表明尿液 miRNA 含量的變化可以成為監測膀胱癌病情發展的新一代生物標志物。

此外，還有報道胸腹水上清液中miR-24及miR-30d與藥物敏感性有關，并且可用于胸腹水良惡性的鑒別診斷。而在人體乳汁及精液等體液中[34]也存在一定數量的異常miRNA分子，但它們是否可用于疾病的診斷，這還有待進一步研究并闡明。

4 miRNA與疾病治療

當前miRNA應用于腫瘤治療主要有三種途徑：（1）對有類癌基因作用的miRNAs如miR-155、miR-372和miR-373，可通過引入沉默miRNA互補片段即抗miRNA寡聚核苷酸（Anti-miRNA oligonucleotides，AMOs）、鎖定核酸修飾的寡核苷酸（LNA-modified oligonucleotide）及miRNA拮抗分子 （antagomirs）等通過抑制其生物學作用而達到治療疾病的目的，此方法毒性低、副作用小并且穩定性高[35]。（2）利用病毒或者脂質體組成的表達系統引入let-7和miR-15a/16等腫瘤抑制基因miRNAs使其呈過度表達，進而發揮強大的抑癌作用[36]。（3）對于已經鑒定的組織/細胞miRNAs，可根據藥物作用前后其表達特點來制備個性化治療方案。如肝癌患者細胞miR-122表達量的顯著下降與化療藥物阿霉素發生耐藥顯著相關，提示實時檢測miR-122的表達水平可為評估藥物化療效果提供了一種新的方法。miR-26在某些肝癌患者體內呈持續性低表達，而研究表明此類患者更適宜干擾素治療。乳腺癌患者miR-328可以用來判斷機體對藥物米托蒽醌的敏感性和耐藥性。

此外，研究證實miR-146a作為調節分子參與了系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）I型干擾素通路的異常激活，調節患者體內miR-146a的表達量，為SLE提供新的治療手段[37]。最新又有報道miRNA與丙型肝炎病毒及I型靈長類泡沫病毒關系密切，提示深入研究miRNA在病毒中的表達變化與特點，可為臨床帶來新的抗病毒治療方案。

5 問題和展望

雖然當前對miRNA及其與醫學相關的研究都已經取得一定進展，但仍有許多迷團有待于探索和解決。例如，miRNA有關SNPs的具體發生部位?SNPs如何影響miRNA 和 mRNA的相互作用？循環miRNA的來源？循環miRNA作為生物標志物應用于臨床還存在很多問題（檢測方法的準確性和靈敏度、研究病種的全面性、病例數量的有限性等）怎樣解決和完善？miRNA作為治療性藥物又如何從理論研究轉為臨床實踐？我們相信隨著這些問題的解決，miRNA將為生命科學、遺傳學以及臨床醫學等領域帶來一場新的革命。

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